特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是老年人常见的疾病，高发年龄为55-70岁，其主要病理改变为成纤维细胞增生和细胞外基质沉积，通常会有多种合并症，这些合并症的存在对患者的生活质量及存活率有着明显的影响，甚至远远超过了呼吸困难本身。该病目前尚无有效治疗方法，因此，及时发现并减少并发症，改善患者预后是治疗的关键。　　目前研究证实IPF中异常的纤维化过程形成疤痕病灶，可能是肺癌发生的潜在病灶，研究证实纤维化明显的区域，更易合并肺癌，以非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）为主要病理类型。IPF合并肺癌的机理尚未完全阐明。一些信号通路被证实参与了这个过程，尤其是P53信号通路。近几年的研究也证实，长链非编码RNA（Long Noncoding RNA，LncRNA）介入了肺癌及IPF的发生发展。那么LncRNA是否在IPF中异常表达并促进其合并肺癌的过程机制如何。是否通过P53通路促进肿瘤的形成。　　为此，本课题收集IPF患者外周血液标本，通过高通量测序检测其LncRNA及mRNA的差异表达，筛选出与肺癌通路相关的LncRNA及mRNA，通过同源性检测后，进行动物实验进一步验证其相互关系，以期进一步阐明LncRNA在IPF中的作用以及促进合并肺癌的作用机制，为早期发现其合并症提供新的思路。　　本课题包括三部分，5个实验，分述如下：　　第一部分：特发性肺间质纤维化患者外周血LncRNA测序分析及验证　　实验一：特发性肺纤维化患者外周血LncRNA测序分析　　目的：　　检测IPF患者外周血非编码长链RNA（LncRNA）表达变化，通过生物信息学分析筛选出与癌症P53通路相关的差异LncRNA及mRNA。　　方法：　　根据IPF诊断标准筛选4名患者和4名一般情况相当的健康自愿者，两组患者均无高血压糖尿病等其他疾病。分别留取患者静脉血3ml，抽取RNA通过高通量测序法检测LncRNA和mRNA的表达，通过生物信息学分析，选出差异表达的LncRNA和mRNA，应用GO分析和PATHWAY分析软件，筛选出与肿瘤发生相关的mRNA。　　结果：　　1、通过高通量测序检测结果发现，IPF患者外周血LncRNA与正常对照组相比较，共有440个表达上调，1376个表达下调。　　2、通过生物信息学分析显示LncRNA（CDKN2B-AS1）表达明显下调，而且它的邻近基因mRNA（CDKN2A）表达也明显下调（P<0.05)。　　3、应用GO分析及PATHWAY分析软件分析发现CDKN2A富集在P53信号通路和NSCLC信号通路上，应用Fisher法进行计算，结果显示P值分别为0.013和0.0039。　　实验二： CDKN2B-AS1和CDKN2A在IPF患者外周血中表达的验证　　目的：　　通过检测20例IPF患者外周血，进一步验证LncRNA CDKN2B-AS1和其邻近基因CDKN2A mRNA的差异表达。　　方法：　　再选取20例IPF患者和20例对照组，分别留取静脉血抽提RNA进行PCR检测，验证筛选出来的LncRNA和mRNA在两组的差异表达。　　结果：　　对20例IPF患者外周血进行RT-PCR验证，同样发现CDKN2B-AS1和CDKN2A在IPF组表达较对照组明显下调。　　第二部分：CDKN2B-AS1和CDKN2A在肺癌组织表达检测　　实验三：人体肺癌组织和癌旁正常肺组织CDKN2B-AS1和CDKN2A含量检测　　目的：　　检测CDKN2B-AS1和CDKN2A在肺癌组织中有无差异表达。　　方法：　　选取6例肺癌手术病人的癌标本和6例癌旁正常肺组织标本，PCR法检测CDKN2B-AS1、CDKN2A分别在癌组织和癌旁正常肺组织的表达。　　结果：　　在肺癌组织中CDKN2B-AS1和CDKN2A表达均较周围癌旁正常肺组织明显下调，差异有统计学意义。　　第三部分：CDKN2B-AS1、CDKN2A低表达对P53的表达的影响　　实验四：博来霉素诱导鼠纤维化模型CDKN2B-AS1、CDKN2A和P53表达检测　　目的：　　通过动物实验进一步分析CDKN2B-AS1、CDKN2A的表达以及P53表达。进一步探讨二者在IPF和肺癌中的作用机理。　　方法：　　通过生物信息学分析显示该LncRNA在人类和小鼠中的同源性比较高。选取48只SPF级雄性野生C57BL/6小鼠随机分为四组：正常组、肺纤维化组、肺癌组，肺纤维化合并肺癌组，每组12只，分别造模，建立肺纤维化动物模型和肺癌动物模型以及肺纤维化合并肺癌模型，分别留取肺组织及血液标本。通过HE染色、Masson染色观察纤维化程度， PCR法检测CDKN2B-AS1、CDKN2A mRNA在各组中的表达，western-blot法检测P53、CDKN2A蛋白在各组中的表达。　　结果：　　1、RT-PCR检测结果发现CDKN2B-AS1和CDKN2A在肺纤维化组表达较正常组明显下调，在肺纤维化合并肺癌组下调更明显，与正常组相比有统计学意义（P＜0.05），CDKN2B-AS1和CDKN2A呈正相关，Pearson相关系数为0.985，P=0.000，CDKN2B-AS1和P53呈正相关，Pearson相关系数为0.860，P=0.000。　　2、western法结果发现CDKN2A、P53蛋白在正常组表达明显，肺纤维化组下降，肺纤维化合并肺癌组下降更明显，与正常组相比有统计学意义（P＜0.05）。　　实验五：细胞水平检测CDKN2B-AS1、P53和CDKN2A表达　　目的：　　通过细胞培养进一步验证CDKN2B-AS1、CDKN2A的调控表达以及CDKN2A对P53表达的影响。进一步探讨IPF合并肺癌的作用机理。　　方法：　　培养MRC5细胞，使用TGF-β1建立纤维化细胞模型。使用siRNA干扰CDKN2B-AS1。随机分为6组，正常组、干预组（加入TGF-β1干预）、阴性siRNA组、阴性siRNA干预组、阳性siRNA组、阳性siRNA干预组。倒置相差显微镜观察各组的形态变化，PCR法检测CDKN2B-AS1、CDKN2A在各组中的表达，western法检测P53、CDKN2A在各组中的表达。　　结果：　　1、细胞水平倒置相差显微镜观察发现TGF-β1干预后，MRC5细胞形态变得更加细长。　　2、PCR验证发现siRNA干扰后，CDKN2B-AS1和CDKN2A基本不表达。Pearson检验CDKN2B-AS1和CDKN2A呈正相关，Pearson相关系数为0.988，P=0.000，进一步说明CDKN2B-AS1和CDKN2A是临近基因的关系，CDKN2B-AS1通过调控CDKN2A来发挥作用。　　3、western-blot检测结果TGF-?干预后CDKN2A蛋白表达减少，P53蛋白表达也明显减少。　　4、TGF-β1干预后MRC5细胞CDKN2B-AS1、CDKN2A和P53的表达均明显减少，Pearson检验结果CDKN2B-AS1和P53呈正相关，Pearson相关系数为0.772，P=0.000，提示CDKN2B-AS1与P53可能存在调控关系。　　结论：　　1、IPF患者外周血中LncRNA和mRNA存在差异表达，其中CDKN2B-AS1和它的邻近基因CDKN2A表达明显下调。　　2、CDKN2B-AS1和CDKN2A在肺癌组织中表达减少，可能参与了肺癌的发生发展。　　3、LncRNA（CDKN2B-AS1）可能通过调控它的邻近基因mRNA（CDKN2A）影响P53信号通路，导致肺纤维化合并肺癌的风险增高。　　4、通过细胞实验进一步证实了CDKN2B-AS1通过调控CDKN2A发挥作用，TGF-β1干预后MRC5细胞CDKN2A和P53的表达均明显减少，进而证实CDKN2B-AS1与P53可能存在调控关系。