乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,转移是引起患者死亡的主要原因。区域淋巴道转移是其最早发生及最常见的转移途径,腋窝淋巴结的情况是乳腺癌独立的重要预后因素。因此,准确判断其状态,彻底清除阳性淋巴结是乳腺癌诊断及综合治疗的关键环节。由于条件和技术限制,前哨淋巴结活检在国内尚未得到推广普及,乳腺癌腋窝淋巴结清扫术仍是浸润性乳腺癌最常用的治疗方式。在清扫腋窝淋巴结的手术过程中难免会有遗漏掉的转移淋巴结,而传统的全身静脉化疗能进入淋巴系统的药物量较低,导致肿瘤细胞不能得到有效的杀伤,造成乳腺癌复发转移,影响患者预后及生存。为此,寻找一种淋巴示踪剂,不但能够示踪淋巴结,便于识别及手术清除,同时还能将吸附的化疗药带入淋巴系统,缓慢释放药物进行靶向淋巴化疗就显得尤为重要。据报道,纳米炭是一种安全有效的淋巴示踪剂和理想的药物载体。而表阿霉素是治疗乳腺癌常用有效的药物之一。针对上述问题,本研究以纳米炭吸附表阿霉素对乳腺癌腋窝淋巴结示踪及靶向化疗进行初步探索研究。首先,进行纳米炭与表阿霉素最合适的吸附配比及解吸附实验,其次,用乳腺癌两种细胞系MDA-MB-231和MCF-7进行体外培养,研究纳米炭-表阿霉素对两种细胞的体外杀伤或增殖抑制作用,最后,按纳入标准收集临床病例及淋巴结组织标本,初步研究纳米炭及纳米炭-表阿霉素混悬液对人乳腺癌腋窝淋巴结的示踪和靶向化疗作用,为临床乳腺癌的治疗提供新的思路。研究方法和主要结果1.纳米炭对表阿霉素的吸附、解吸附实验研究方法:利用高效液相色谱质谱(LC-MS/MS)法和透析法测定纳米炭对不同浓度表阿霉素的吸附和释放作用。结果:纳米炭对表阿霉素具有良好的吸附性,1ml(50mg)纳米炭与2ml浓度为2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml表阿霉素吸附率分别为94.66%、85.96%、80.12%、71.09%、69.03%,随着药物浓度的增加,吸附率逐渐降低,达饱和后吸附率稳定。1 ml(50mg)纳米炭与2 ml浓度为5 mg/ml表阿霉素吸附后可以缓慢释放表阿霉素,没有突释现象发现,48 h后趋于平衡,累积释放率可达到65%左右。2.纳米炭-表阿霉素对乳腺癌细胞的增殖抑制作用研究方法:采用不同浓度的cnp-epi处理mda-mb-231、mcf-7细胞,cck-8法测定不同浓度、不同时间对mda-mb-231、mcf-7细胞增殖的抑制作用;根据测定的ic50选取5μg/mlcnp-epi,相应浓度25μg/mlcnp及仅加培养基作用24h后,观察细胞形态的变化,流式细胞仪(flowcytometry,fcm)测定细胞凋亡率。结果:在1μg/ml~200μg/ml浓度范围内,cnp-epi对乳腺癌mda-mb-231、mcf-7细胞增殖的抑制作用逐渐增强,48h后仍有增加的趋势,但逐渐趋于稳定,且各时间段内对细胞的抑制率与药物浓度呈现剂量依赖关系,与正常对照组比较,差异有统计学意义(p<0.05),而相应各浓度cnp对细胞的增殖抑制作用不明显;5μg/mlcnp-epi作用细胞24h后,显微镜下可以看到大量的细胞死亡,正常对照组和相应浓度的cnp组细胞生长未见明显异常;流式细胞仪检测,cnp-epi组作用两种细胞24h后,mda-mb-231细胞的凋亡率为(14.37±6.25)%,死亡率可达(80.70±6.20)%;mcf-7细胞晚期凋亡率为(14.57±2.41)%,死亡率可达(78.63±0.55)%,分别与相应浓度cnp组及正常对照组相比,差异有统计学意义(p<0.05)。3.纳米炭混悬液在乳腺癌腋窝淋巴结示踪效果的临床研究方法:将我科2012年5月至2014年6月收治的60例乳腺癌患者随机分为a组、b组、c组。a组20例,于术前1天在乳晕周围分4点皮下注射纳米炭混悬液1ml;b组20例,于术前3天在乳晕周围分4点皮下注射纳米炭混悬液1ml;c组20例,于术前7天在乳晕周围分4点皮下注射纳米炭混悬液1ml。手术方式采用开放乳腺癌改良根治术或腔镜下皮下腺体切除加腋窝淋巴结清扫术或乳腺癌局部扩大切除加腋窝淋巴结清扫术,术后分别记录淋巴结清扫数目、淋巴结黑染、转移情况。结果:a组共清除淋巴结430枚,平均21.5±5.8枚;b组共清除淋巴结384枚,平均19.2±4.9枚;c组共清除淋巴结380枚,平均19.0±5.8枚;a组、b组、c组平均每例患者清除淋巴结数目比较,差异无统计学意义(p>0.05)。a组清除的430枚淋巴结中,黑染337枚,黑染率78.4%;b组清除的384枚淋巴结中,黑染248枚,黑染率64.6%;c组清除的380枚淋巴结中,黑染166枚,黑染率43.7%;三组间淋巴结黑染率比较,差异有统计学意义(p<0.05),可以认为三组清除淋巴结总体黑染率之间有差别,a组淋巴结黑染率最高,c组淋巴结黑染率最低。a组共清除转移淋巴结40枚,其中黑染淋巴结28枚,转移淋巴结中黑染率70.0%(28/40);b组共清除转移淋巴结54枚,其中黑染淋巴结33枚,转移淋巴结中黑染率为61.1%(33/54);c组共清除转移淋巴结39枚,其中黑染淋巴结22枚,转移淋巴结中黑染率56.4%(22/39)。三组比较,转移淋巴结的黑染率差异无统计学意义(p>0.05)。4.纳米炭-表阿霉素在乳腺癌阳性淋巴结靶向化疗中作用的研究方法:将我科2014年2月至2014年12月收治的90例乳腺癌患者随机分为对照组、示踪组、载药组。对照组30例,未注射任何示踪剂。示踪组30例于术前24h在乳晕周围分4点皮下注射纳米炭混悬液1ml。载药组30例于术前24h在乳晕周围分4点皮下注射纳米炭-表阿霉素混悬液3ml。手术方式采用开放乳腺癌改良根治术或腔镜下皮下腺体切除加腋窝淋巴结清扫术或乳腺癌局部扩大切除加腋窝淋巴结清扫术,每个患者选取淋巴结均不超过2枚。将所取淋巴结平均分成两份,一份送常规病理学检查,另一份再平均分成两小份,一份福尔马林固定,石蜡包埋备做细胞凋亡和免疫组化检查,另一份置于-70℃冰箱冷藏保存,做表阿霉素浓度测定用。剩余淋巴结均送病理科检查。常规he染色筛选出有癌转移的淋巴结,载药、示踪组选取黑染及未黑染的癌转移淋巴结,对照组选取癌转移淋巴结连续切片,做免疫组化ki-67染色和tunel染色。结果:载药组黑染淋巴结中表阿霉素浓度为(2063.27±1236.39)ng/g,未黑染淋巴结中表阿霉素浓度为(108.77±96.39)ng/g;示踪组黑染淋巴结中表阿霉素浓度为(143.72±89.36)ng/g,未黑染淋巴结中表阿霉素浓度为(110.68±56.00)ng/g;对照组淋巴结中表阿霉素浓度为(125.85±72.29)ng/g;载药组黑染淋巴结中表阿霉素浓度明显高于示踪组黑染、未黑染和对照组,差异有统计学意义(p<0.05);载药组未黑染淋巴结中表阿霉素浓度同示踪组黑染、未黑染和对照组比较,无明显差异(p>0.05);示踪组黑染淋巴结中表阿霉素浓与示踪组未黑染和对照组之间两两比较,无显著差异(p>0.05);载药组黑染淋巴结中表阿霉素浓度明显高于未黑染淋巴结,差异有统计学意义(p<0.05);载药组黑染癌转移淋巴结中癌细胞ki-67增殖指数为(2.34±0.54)%;示踪组黑染癌转移淋巴结中癌细胞ki-67增殖指数为(2.49±1.37)%;对照组癌转移淋巴结中癌细胞ki-67增殖指数为(4.81±3.56)%;三组癌转移淋巴结中癌细胞ki-67增殖指数无显著差异(p>0.05)载药组黑染癌转移淋巴结中癌细胞凋亡指数为(14.19±6.96)%;示踪组黑染癌转移淋巴结中癌细胞凋亡指数为(7.59±2.84)%;对照组癌转移淋巴结中癌细胞凋亡指数为(10.24±3.47)%;三组癌细胞凋亡指数无显著差异(p>0.05)结论1、纳米炭对表阿霉素具有良好的吸附性能和缓释作用,1ml纳米炭与2ml表阿霉素浓度为5mg/ml~10mg/ml混合配比较合适;2、CNP-EPI混悬液对人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞增殖有明显抑制或杀伤作用,其抑制作用是通过其缓慢释放的表阿霉素直接杀伤癌细胞或诱导其凋亡实现;3、术前1天乳晕周围皮下注射纳米炭混悬液腋窝淋巴结黑染率较高,可达到良好的淋巴示踪效果;转移的淋巴结也大部分染色,便于术中辨认,有助于转移淋巴结清除;4、纳米炭-表阿霉素混悬液既可示踪腋窝淋巴结又能增加黑染癌转移淋巴结中化疗药物浓度,延长化疗药物在淋巴结中的作用时间,可能会起到淋巴结靶向化疗的作用。