论文部分内容阅读
实验目的: 探讨雷公藤红素(Celastrol,Cel)对小鼠骨髓诱导破骨细胞分化及胶原诱导的关节炎小鼠(CIA)模型局部关节炎症及骨侵蚀的影响,以及Cel对破骨细胞分化过程中及CIA小鼠中趋化因子CXCL2表达的作用。 实验方法: 1.细胞实验 采用骨髓诱导破骨细胞的方法培养破骨细胞,检测破骨细胞中趋化因子的表达及Cel对破骨细胞中CXCL2表达的影响。实验包括:1.取小鼠骨髓细胞,加入MCSF及RANKL细胞因子诱导形成破骨细胞;2.通过CCK8法测定Cel对骨髓细胞活性的影响,确定不影响细胞活性的安全浓度范围;3.通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察Cel对破骨细胞的影响;4.荧光实时定量PCR(Real-time PCR)检测相关趋化因子,如CXCL2、CXCL9、CXCL11的相对表达量及Cel对趋化因子表达的影响。 2.动物实验 建立胶原CIA小鼠模型,检测Cel对CIA小鼠关节炎症的作用并探讨相关趋化因子与骨侵蚀的相关性。实验包括:1.建立CIA模型,观察小鼠体征并记录小鼠的体重变化;2.根据小鼠关节炎评分标准进行评分;3.通过HE染色等病理学方法观察Cel对CIA小鼠关节的炎症及骨侵蚀的作用;4.通过小鼠关节Micro-CT三维重建及关节中TRAP的表达,直观观察Cel对CIA小鼠关节破坏及体内破骨细胞分化及功能的影响;5.通过ELISA方法检测Cel对CIA小鼠血清中CXCL2的影响;6.通过荧光实时定量PCR(Real-time PCR)检测Cel对CIA小鼠关节CXCL2及其受体的表达影响。 实验结果: 1.细胞实验: 通过CCK8法测定结果显示,Cel浓度为1μ M、2μ M,5μ M时,明显影响小鼠骨髓细胞的活性,而Cel浓度为0.1μ M、0.25μ M及0.5μ M时,对细胞活性无明显影响,因此选用0.1μ M、0.25μ M、0.5μ M三个浓度进行实验;通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察其细胞胞体大、形态不规则、酶活性部分(胞质)呈转红色、多核(大于等于3核)的巨噬细胞为破骨细胞,Cel对破骨细胞的形成有明显抑制作用,且成浓度依赖性;荧光实时定量PCR检测结果显示:CXCL2在破骨细胞中表达升高,Cel能够明显抑制破骨细胞形成过程中CXCL2的表达,且在一定浓度范围内呈浓度依赖性。 2.动物实验: 根据关节炎评分标准,Cel组关节炎评分较胶原诱导关节炎组降低明显(P<0.01),提示Cel能够明显抑制CIA小鼠关节的肿胀;HE染色结果显示,Cel能明显减少关节周围炎性细胞浸润及关节破坏;Micro-CT及关节TRAP染色结果显示,Cel能够有效抑制CIA小鼠关节中破骨细胞的数量和骨侵蚀程度。ELISA实验结果显示,CIA组小鼠血清中CXCL2表达相对于空白对照组升高,Cel能显著抑制胶原诱导关节炎小鼠血清中CXCL2的表达(P=0.0003)。荧光实时定量PCR结果显示,CIA组小鼠关节中CXCL2及CXCR2的表达均升高,其中CXCL2的表达升高更为明显(P<0.0161),Cel能显著抑制关节中CXCL2及其受体的表达。 结论: 1.趋化因子CXCL2在破骨细胞形成的过程中高表达,提示CXCL2可能在破骨形成的阶段发挥作用;2.Cel能够抑制小鼠骨髓细胞诱导破骨细胞的形成及分化;3.趋化因子CXCL2在CIA小鼠中高表达,可能参与了骨侵蚀的过程;4.Cel能够抑制CIA小鼠关节的炎症反应及骨侵蚀;5.Cel可能通过下调趋化因子CXCL2及其受体的表达在CIA小鼠关节炎症和骨侵蚀过程中发挥重要作用。