随着越来越多的基因组序列相继被识别,人类对生物本质的认识已经发生了重大的变化,如何利用这些基因信息来研究其功能呢?在基础研究中,比较常用的方法是利用转基因技术和基因打靶技术构建动物模型来进行相关的研究。在生产基因修饰的大动物的过程中,基于克隆技术的转基因动物和基因打靶动物模型的制作在医学及基础科学等领域的研究中处于举足轻重的地位。目前家兔已经被广泛用作模拟研究人类相关疾病的实验动物模型,包括心血管疾病、代谢疾病、呼吸系统疾病和各种类型的癌症疾病。兔具有一些优于其他实验动物的特性:其体型能够允许一些不能在小鼠和大鼠身上实施的手术得以实现,而且它们系统发生上更接近人类。此外,在人类生殖领域研究中,一些基因的高度保守性显示兔将是研究人类胚胎植入前发育的一个有价值的动物模型,而且其胚胎和胎儿-胎盘发育与人类相似。然而,目前仅有数量有限的转基因兔和自然突变兔模型可供研究,因此通过基因改造获得实验动物模型兔具有非常广阔的应用前景和理论价值。本研究以家兔克隆技术为基础构建基因修饰兔模型,分两部分内容:(一)我们构建了兔Oct4启动子驱动EGFP表达的一个报告质粒(pr OG),并通过体细胞转染和核移植技术(SCNT)获得了pr OG转基因克隆兔。pr OG转基因胚胎和pr OG转基因兔F1代胚胎均能观察到绿色荧光的表达,而且在27 dpc兔胎儿生殖器官也有绿色荧光的表达。之后,我们分别建立培养了pr OG-SSCs和pr OG-ES细胞系,观察到绿色荧光的表达;并且发现了兔ES细胞的异质性,分离两种细胞后进行了初步的表观遗传分析。pr OG转基因兔作为研究兔多能性细胞来源和维持的一个新模型,为兔多能性细胞的相关研究提供了便利,同时也可能会进一步促进兔胚胎发生过程中的机理研究。(二)在这部分研究中,我们阐述了通过重组型腺相关病毒(r AAV)介导的HPRT基因同源重组打靶克隆兔的制作过程。为了提高基因的靶向效率,我们采用了基因捕获的设计策略。通过不同的设计策略,分别建立了雄性和雌性不同类型的基因打靶成纤维细胞系;将雄性HPRT敲除细胞系用于SCNT,但没有获得存活的克隆兔;而将雌性HPRT+/-细胞系用于SCNT后,获得了存活的健康克隆兔,并且HPRT+/-克隆兔能够成长到性成熟,并产生基因修饰稳定遗传的后代。我们使用的方法为敲除效率较低的细胞系的基因操作设计提供了一个新思路,这种方法也可以被用于不同基因或其他物种的基因操作。我们通过克隆技术和基因修饰构建的这两种兔模型能够为遗传发育研究及人类相关疾病研究提供一个可操作的工具。