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E-cadherin蛋白(CDH1)是一种钙依赖性的上皮细胞间的粘附蛋白,在耳蜗感觉细胞和支持细胞中几乎均有表达。它在Corti器的发育和结构及功能的维持中有重要作用。前期研究表明噪声暴露后E-cadherin在大鼠耳蜗感觉上皮组织中的表达量增加。但目前还不清楚噪声暴露导致E-cadherin的增加是由Corti氏器中的哪种细胞引起的以及其表达量增加的作用是什么。因此,有必要对E-cadherin在噪声损伤中的作用作进一步深入研究。本研究综合运用诱导性条件基因敲除,显微分离,激光共聚焦,免疫透射电镜等细胞分子生物学技术,探索E-cadherin分子在急性噪声损伤中的作用。实验分为以下三个部分:第一部分E-cadherin条件转基因小鼠模型的建立本部分实验的目的是获得仅在内外毛细胞或外毛细胞中将E-cadherin基因敲除的条件转基因敲除小鼠。通过应用Cre/loxP技术,将B6.129-Cdh1tm2Kem/J小鼠与Tg(Atoh1-cre/Esr1*)14Fsh/J小鼠和Prestin-CreERT2小鼠进行杂交配对和筛选。上述两种Cre小鼠为诱导性的Cre系统,只有与Tamoxifen相结合时才能启动Cre重组酶的活性。因此通过药物诱导可以对E-cadherin基因的敲除实现时间和空间两个方面的控制。本实验中首先将配对后所得的两种条件转基因小鼠:Cdh1-loxP/Atoh1-cre小鼠和Cdh1-loxP/Prestin-CreERT2小鼠进行基因分型,初步筛选获得基因型Cdh1-loxP为纯和表达的转基因小鼠。同时进一步通过免疫荧光组织染色法检测所得小鼠在Tamoxifen诱导后Cre重组酶的表达活性,判断小鼠的Cre/loxP重组酶是否工作正常。最后使用脑干诱发电位法对条件转基因小鼠的听力水平进行检测,为下一步噪声暴露实验提供听阈水平的基线。实验筛选得到了符合后续实验要求的条件转基因小鼠Cdh1-loxP (+/+) Prestin-CreERT2(+/-),为后续研究噪声暴露后E-cadherin在耳蜗内的表达变化和结构改变提供了动物模型。第二部分高纯度内耳细胞显微分离技术的建立本部分实验的目的是建立一种样本中RNA保存完好的毛细胞富集组织(Haircell-enriched tissue)的提取方法。耳蜗病变分子生物学研究的成功依赖于高品质耳蜗样本的收集。由于耳蜗结构的复杂性,从哺乳动物耳蜗中分离感觉细胞富集的样本一直是一个挑战。本研究采用显微解剖技术分离感觉细胞富集的耳蜗组织样本,使感觉细胞的纯度显著提高。同已前方法中获得的感觉上皮组织相比,新方法制备的样品中含有了一个相对稳定感觉细胞/支持细胞的比例,并且样品中的RNA保存完好。使用该显微解剖方法,我们能够收集小鼠耳蜗中分离的三种组织类型:感觉细胞富集组织,外毛细胞富集组织和内毛细胞富集组织。所有样本可以用于相关的下游分析,包括qRT-PCR,微阵列和RNA测序等。第三部分E-cadherin在急性噪声损伤中的分子机制本部分实验的目的是研究E-cadherin在急性噪声损伤中围绕外毛细胞(OHC)所发生的变化。分析该分子在外毛细胞富集组织中RNA转录水平的改变及在Corti氏器的位置结构变化,初步理解E-cadherin在急性噪声损伤中的分子机制。实验利用条件转基因小鼠模型研究外毛细胞在cdh1基因被敲除后E-cadherin在网状层中的变化,使用外毛细胞富集组织分离方法开展相关细胞粘附分子qRT-PCR检测,应用3D重建和免疫透射电镜技术观察网状层外毛细胞与Deiters细胞之间E-cadherin连接的位置结构。结论如下:1.急性噪声损伤后,外毛细胞周围E-cadherin的表达增加是由Deiters细胞引起的;2. Deiters细胞中的E-cadherin通过指状突连接网状层;3.急性噪声损伤后,Deiters细胞之间通过过量表达E-cadherin封闭由毛细胞凋亡后的空缺,维持网状层的完整性。