研究目的:本研究旨在观察熟大黄（Stewed Rhubarb,SR）对0.2%腺嘌呤饲料诱导慢性肾衰竭（Chronic renal failure,CRF）小鼠的肾功能指标、肾脏病理变化、肾脏炎症、肾脏水液代谢、肾纤维化、肠道屏障完整性、肠道菌群结构和肠道菌群代谢物的影响。研究SR对CRF的治疗作用,并深入探讨肠道菌群在其中扮演的角色,为临床运用SR治疗CRF提供科学依据。研究方法:1.基于CRF的病因、病机、治法以及“肠-肾轴”理论的认识,对SR治疗CRF进行中医理论的分析和探讨。2.选取了雄性C57BL/6小鼠作为实验动物,使用0.2%的腺嘌呤饲料作为造模药物构建CRF模型。3.将36只雄性C57BL/6小鼠随机分为4组,每组9只。对照组（Ctrl组）和熟大黄单给药组（Ctrl+SR组）给予正常饲料喂养,模型组（CRF组）和模型+熟大黄组（CRF+SR组）采用0.2%腺嘌呤饲料喂养的方法制备慢性肾衰竭小鼠模型。实验周期共为6周。给药方法如下:Ctrl组和CRF组在第5周起给予生理盐水灌胃,给药周期为2周。Ctrl+SR组和CRF+SR组在第5周起给予SR水煎液（2 g/kg·d）灌胃,给药周期为2周。实验过程中记录小鼠体重、饮食、饮水等指标。实验结束后观察各组小鼠肾脏外观、血尿素、血肌酐、肾脏病理（H＆E染色、PAS染色、MASSON染色）变化。进一步通过RT-PCR技术检测SR对CRF小鼠肾脏炎症（NLRP3、TLR4、IL-1β、TNF-α）、肾脏水液代谢（AQP2-4）、肾纤维化相关因子（E-Cadherin、Col1a1和Fibronectin）影响,采用Western Blotting技术检测SR对CRF小鼠肾纤维化相关的GSK-3β/β-catenin信号通路的影响,以求证实SR对CRF的治疗作用。4.观察各组小鼠结肠长度及结肠病理切片（H＆E染色、阿尔新蓝染色和WGA染色）,进一步通过RT-PCR技术检测肠道屏障相关因子变化。采用16S r DNA测序技术对小鼠肠道菌群进行生物信息学分析,探讨SR干预后CRF小鼠肠道菌群多样性、丰度及代谢通路的变化。并进一步使用气质联用和液质联用技术测定粪便中肠道菌群主要代谢产物（短链脂肪酸、胆汁酸、吲哚）的变化,研究SR对肠道菌群关键代谢产物的调控作用。5.将36只雄性C57BL/6小鼠随机分为4组,每组9只。建立抗生素（AB）处理的肠道微生物耗竭CRF小鼠模型,饮水上,Ctrl组和CRF组给予正常饮水直到实验结束,CRF+AB组和CRF+AB+SR组给予混合抗生素饮水直到实验结束。在抗生素预先处理4周后,采用RT-PCR法检测主要菌属的含量。在观察到肠道微生物耗竭之后（第5周起）,Ctrl组给予正常饲料喂养,CRF组、CRF+AB组、CRF+AB+SR组采用0.2%腺嘌呤饲料喂养的方法制备CRF小鼠模型。造模周期6周。给药方法如下:Ctrl组、CRF组、CRF+AB组在第9周起给予生理盐水灌胃,给药周期为2周。CRF+AB+SR组在第9周起给予SR水煎液（2 g/kg·d）灌胃,给药周期为2周。实验过程中记录小鼠体重、饮食、饮水等指标。实验结束后观察和检测各组小鼠肾脏外观、结肠长度、血尿素、血肌酐、肾脏和肠道的病理变化。并通过RT-PCR技术检测SR对肠道微生物耗竭CRF小鼠肾脏炎症、肾脏水液代谢、肾纤维化和肠道屏障完整性相关因子影响。研究结果:1.本研究认为SR治疗CRF有着全面深刻的理论渊源,SR“从肠论治”CRF主要是通过通腑泄浊法和活血化瘀法调节“脾、肠、肾”三者关系。并结合肠道微生态的热点内容,推测SR治疗CRF可能是通过调节肠道菌群及其代谢产物发挥作用。2.本研究使用0.2%腺嘌呤饲料构建CRF模型。在喂养6周腺嘌呤饲料后,CRF小鼠体重下降明显（P＜0.01）,肾脏指数明显降低（P＜0.01）。肾脏外观观察发现,CRF小鼠肾脏萎缩明显,外观呈苍白色,颗粒状明显,显示存在肾损伤。CRF小鼠血浆肾功能指标肌酐和尿素明显上升（P＜0.01）,CRF小鼠肾脏H＆E切片显示肾小球硬化,肾小管损伤,以上指标证实CRF小鼠模型成功。此外,由于腺嘌呤饲料的使用直接作用于肠道,因此也观察结肠的变化,发现CRF小鼠结肠明显缩短（P＜0.01）,结肠H＆E切片也显示CRF小鼠肠壁水肿,肌层变薄等病理变化。这也说明了CRF小鼠的肠道有一定程度的损伤,也为下一步实验提供了思路。3.SR干预CRF小鼠后,可以显著减少CRF小鼠体重下降（P＜0.05）、降低血尿素和血肌酐水平（P＜0.01）,改善CRF小鼠肾脏外观形态,减少CRF小鼠造成的饮水量增多（P＜0.05）,以及减少CRF小鼠肾脏指数的降低（P＜0.05）。H＆E染色、PAS染色、MASSON染色显示SR可以显著改善肾脏的病理变化,减轻肾纤维化和肾小球硬化、肾小管扩张、肾小管萎缩等病理变化。经过RTPCR技术证实SR可以在m RNA水平有效改善肾脏的炎症、水液代谢、肾纤维化因子的变化,且SR可通过抑制GSK-3β/β-Catenin信号通路缓解肾纤维化。4.SR可显著改善了CRF小鼠结肠缩短（P＜0.05）。H＆E染色、阿尔新蓝染色、WGA染色显示SR可以改善CRF所导致的结肠病理变化,保护肠道屏障完整性,减轻肠道水肿,减少肠道黏蛋白的丢失。SR在m RNA水平上改善了CRF小鼠肠道屏障相关因子的下调（P＜0.05或0.01）,显示SR保护了CRF小鼠肠道屏障。菌群分析显示,SR逆转了CRF小鼠细菌α多样性的上调（P＜0.05）。β多样性分析结果:主成分分析（PCA）和非度量多维尺度图（NMDS）表明四个实验组的肠道菌群结构各不相同。细菌分类在门水平上,CRF组与Ctrl组相比,厚壁菌门（Firmicutes）和软壁菌门（Tenericutes）的丰度上升,疣微菌门（Verrucomicrobia）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度下降。SR治疗后,对CRF小鼠的这些门变化无影响。在科水平上,CRF组中拟杆菌科（Bacteroidaceae）丰度的增长,以及理研菌科（Rikenellaceae）和丹毒菌科（Erysipelotrichaceae）在丰度下降,SR逆转了上述细菌在科水平的变化。在属水平上,CRF组中一系列细菌的丰度发生了显著变化。相比Ctrl组,CRF组细小杆菌属（Parvibacter）在丰度减少（P＜0.05）,而内脏臭气杆菌（Odoribacter）、醋酸菌属（Acetatifactor）、另枝菌属（Alistipes）、厌氧棍状菌属（Anaerotruncus）、布劳特氏菌属（Blautia）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、肠球菌属（Enterococcus）、毛螺旋菌属（Lachnospiraceae）、马文氏菌属（Marvinbryantiaceae）、理研菌属（Rikenellaceae）、理研菌属（Rikenella）、瘤胃梭菌属（Ruminiclostridium）丰度明显上升（P＜0.05）,SR干预后明显改善了CRF所致上述菌属的变化。采用LC/GC-MS对4个试验组的粪便样品中肠道微生物主要代谢产物含量进行了定量分析。CRF小鼠粪便中乙酸水平升高,SR干预后明显降低（P＜0.05）。CRF组小鼠粪便丙酸、戊酸含量明显降低,SR治疗后,丙酸、戊酸含量明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）。同时CRF小鼠粪便中吲哚含量减少（P＜0.01）,吲哚在SR处理后明显增多（P＜0.01）。与Ctrl组相比,CRF小鼠粪便中总胆汁酸显著增加（P＜0.01）。SR干预后未能阻止CRF小鼠总胆汁酸的增加,但在分类胆汁酸相对含量上能抑制去氧胆酸（CDCA）、胆酸（CA）相对比例的变化。进一步对实验组粪便中分类胆汁酸的绝对含量进行测定。相比Ctrl组,CRF组粪便中除牛磺-α-鼠胆酸（T-α-MCA）、牛磺胆酸（TCA）、牛磺脱氧胆酸（TDCA）外,其余胆汁酸水平均升高（P＜0.01）。但在CRF+SR组,牛磺酸脱氧胆酸（TUDCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）含量明显下降（P＜0.05或0.01）,而T-α-MCA、牛磺-β-鼠胆酸（T-β-MCA）含量则进一步升高（P＜0.05或0.01）。采用PICRUST分析评价SR对CRF小鼠肠道菌群代谢途径的影响。筛选出7条变化明显的通路。与Ctrl组比较,CRF组有5条通路受影响（P＜0.01）。其中,色氨酸代谢和酮体合成/降解两条途径的代谢活性上调;三种途径被下调,包括戊糖与葡萄糖醛酸的相互转化、氨基糖与核苷酸糖的代谢、果糖与甘露糖的代谢。相反,SR治疗后,这些改变的通路大部分恢复（P＜0.01或0.05）。相关性分析显示,计算了4个试验组中丰度变化最大的23个属与各项理化指标之间的Spearman’s相关系数。17种细菌（Anaerotruncus、Blautia、Clostridium等）与体重、肾脏指数、E-cadherin水平、SCFA和吲哚代谢呈负相关,与肌酐、尿素、Col1a1、乙酸水平、胆汁酸代谢呈正相关,证实了SR对这些菌属的改变有利于缓解CRF进展。5.在抗生素干预4周之后,测定小鼠粪便中主要菌属,发现肠道菌群基本耗竭。随后发现,SR未能改善肠道微生物耗竭CRF小鼠的体重下降、肾脏指数降低、肾脏的病理变化、肾脏纤维化、肾脏炎症、肾脏水液代谢。SR对于肠道微生物耗竭CRF小鼠结肠缩短和肠道屏障损伤无改善。肠道微生物耗竭的CRF小鼠中,熟大黄未能起到治疗CRF的效果。以此证实在缺失肠道菌群的情况的熟大黄难以发挥药效,说明了熟大黄治疗CRF离不开肠道菌群的转化和代谢,但是由于抗生素能延缓CRF进展,因此需要进一步的粪菌移植实验证实这一结论。研究结论:1.基于中医理论对SR治疗CRF进行探讨,认为SR“从肠论治”CRF是主要通过通腑泄浊法和活血化瘀法对脾胃、肠、肾三者关系调节达到治疗的作用,这也为研究的进一步探索提供理论指导。2.0.2%的腺嘌呤饲料可以成功构建CRF小鼠模型,该方法具有造模方便,模型稳定,死亡率低的优点。3.通过SR对CRF小鼠的作用及其机制的研究,证实SR可改善肾功能、肾脏炎症、肾脏水液代谢及肾纤维化。进一步发现重塑失衡的肠道菌群、抑制肠道代谢产物的异常变化是SR治疗CRF的潜在分子机制,主要包括SR保护肠道屏障,调节肠道微生物群的结构,减少致病菌的丰度（例如梭菌属Clostridium）,增加益生菌的丰度（例如微小小单胞菌Parvibacter）,增加有益的肠道菌群代谢产物的含量（例如短链脂肪酸和吲哚）。