背景：1998年,Fire及其同事在线虫类秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现RNA干扰(RNAi)现象,其后3年,Tuschl及其同事化学合成了短双链RNA/小干扰RNA(siRNA),证明了哺乳动物细胞中同样存在RNA干扰现象。由于RNAi现象可以调节基因表达,不仅能作为生物学研究的有力工具,同样可以作为一种极具潜力的疾病治疗方案。癌症,病毒感染,自体免疫疾病,神经性病变已成为RNA干扰治疗的热门疾病靶点。已有RNA干扰药物进入临床试验并显示出极大的治疗效率,首例癌症靶向治疗药物——以环糊精为载体、转铁蛋白为靶向基团的系统给药siRNA制剂(CALAA-01；Calando Pharmaceuticals,Pasadena,CA,USA；phaseⅠ)也已宣告进入一期临床试验。　　 在肿瘤形成早期由于肿瘤组织低氧环境、癌基因激活以及代谢性应激的诱导,使得成熟血管休眠期被打破,促血管新生因子表达上调,发生血管新生。血管新生不仅在生长、繁殖、修复等过程中起着重要的作用,同时也对肿瘤形成、转移及其它许多非肿瘤疾病起决定性作用。如果没有血管的营养供给,肿瘤只能生长1-2mm,因而抑制血管新生为抑制肿瘤的关键,抑制血管新生相关信号通路为抗肿瘤热门靶点。　　 VEGF/VEGFR2通路在肿瘤血管新生中起关键作用,研究发现多种类型的癌症均有血管内皮生长因子(VEGF)的过表达,而血管内皮生长因子受体-2是促VEGF的促血管新生活动的主要受体,两者均是抗肿瘤血管新生疗法的主要靶点。表皮生长因子受体(EGFR)及其配体表皮生长因子(EGF),在癌症进展过程中的肿瘤细胞增殖,凋亡,血管新生,转移等过程起关键作用。EGFR通过激活抗凋亡Akt信号通路对肿瘤细胞提供生存信号,且许多上皮及胶质区域的肿瘤皆有EGFR的过表达。VEGFR2及EGFR是目前研究的最多的抗癌药物靶点,也是非小细胞肺癌(NSCLC)确定的治疗靶点。　　 本研究拟筛选体外高效沉默VEGFR2表达的siRNA,通过阳离子聚合物聚乙烯酰胺(PEI)的包裹作用,给予人非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤移植物裸鼠模型,观察由siRNA介导的VEGFR2表达抑制对肿瘤生长抑制作用及对荷瘤小鼠生存期的改善。同时,我们还探究了EGFR siRNA,EGFRsiRNA联合VEGFR2siRNA的siRNA联合疗法,单一化疗,以及化疗联合两种siRNA的疗法,共8个实验组介导的肿瘤生长抑制作用及对荷瘤小鼠生存期的改善。此外,我们还对荷瘤小鼠的肿瘤组织提取了RNA及蛋白,分别应用实时定量PCR和免疫蛋白印迹方法来检测VEGFR2及EGFR的mRNA及蛋白表达水平,进一步探讨肿瘤进展分子机制。　　 目的：　　 1.以小鼠VEGFR2 mRNA序列为靶设计并合成高效沉默VEGFR2表达的siRNA序列,并在体外细胞实验中验证其沉默效率。　　 2.以聚乙烯酰胺(PEI)作为siRNA体内给药载体,比较VEGFR2 siRNA和/或EGFR siRNA介导的抗血管新生疗法,顺铂所代表的化疗,以及VEGFR2siRNA和EGFR siRNA加上顺铂的联合抗肿瘤疗法之间在人非小细胞肺癌移植瘤裸鼠模型上的肿瘤生长抑制效果及对荷瘤小鼠生存时间的影响。　　 3.通过进一步在mRNA和蛋白水平上对肿瘤组织VEGFR2及EGFR表达量进行检测,探寻各疗法抗肿瘤分子机制。　　 方法：　　 1.根据NCBI公布的小鼠VEGFR2 mRNA序列(NM_010612),设计出3对siRNA序列(siRNA1,siRNA2,siRNA3),加上我们之前研究中所引用过的siRNA序列(siRNA4),一共四个VEGFR2 siRNA分子序列。利用Lipofectamine2000进行体外细胞转染,将各个VEGFR2 siRNA及作为对照的乱序siRNA分子转染进MS1细胞,同时设置未处理组及阴性对照组(仅加入Lipofectamine2000)。转染结束后48小时提取细胞总RNA进行半定量RT-PCR(semi—quantitative RT-PCR)和实时定量PCR(Quantitative real time PCR)以检测VEGFR2 mRNA表达情况。VEGFR2蛋白表达情况则在转染结束后72小时提取细胞总蛋白用免疫蛋白印迹(western blot)方法进行分析。对所有组的目的蛋白及mRNA表达量以内参表达量进行上样量标准化后,以control siRNA作为对照进行归一,采用one—way ANOVA统计方法,根据方差是否齐性选择LSD或者Dunnett T3检验,比较各组mRNA和蛋白表达水平差异显著性。　　 2.对裸鼠皮下接种5×106个A549人非小细胞肺癌细胞以建立肿瘤模型,每隔三天测量小鼠体重及肿瘤体积。肿瘤体积以游标卡尺测量,计算公式为1/2×a×b2,其中a代表长直径,b代表短直径。待肿瘤长至30-100 mm3,将荷瘤小鼠随机分为8组,每组含4—5只。利用阳离子聚合物PEI包裹各个siRNA分子(N/P比为8)形成siRNA/PEI复合物以备瘤内注射用。每组小鼠分别给予(1)saline(生理缓冲液)(瘤内注射,一周两次),(2)PEI(瘤内注射,一周两次),(3)0.5nmol VEGFR2 siRNA(瘤内注射,一周两次),(4)0.5nmol EGFRsiRNA(瘤内注射,一周两次),(5)0.5nmol Control siRNA(瘤内注射,一周两次),(6)0.25nmol VEGFR2 siRNA+0.25nmol EGFR siRNA(瘤内注射,一周两次),(7)5mg/kg顺铂(腹腔注射,一周一次),(8)0.25nmol VEGFR2 siRNA+0.25nmol EGFR siRNA+3mg/kg顺铂(siRNA治疗:瘤内注射,一周两次.顺铂:在每周第一次siRNA给药后的第二天给予腹腔注射,一周一次).实验进行到第40天时,或当老鼠垂死前,对其拍照后进行水合氯醛麻醉,剥离肿瘤组织,对肿瘤组织拍照后立即投入液氮以备RNA及蛋白提取分析。应用析因方差分析比较给药各组肿瘤体积和荷瘤鼠体重是否有统计学差异。对小鼠生存时间进行Kplan-Meier生存分析,并绘制生存曲线得出各组中位生存时间,利用Log—Rank(Mantel—Cox),Breslow(Generalized Wilcoxon),Tarone—Ware检验各组生存时间差异显著性。　　 3.将各实验组冷冻肿瘤组织提取总RNA进行实时定量PCR(Quantitative realtime PCR)以检测VEGFR2及EGFR mRNA表达情况,并提取总蛋白用免疫蛋白印迹(western blot)方法进行分析VEGFR2及EGFR蛋白表达量。对所有组的目的蛋白及mRNA表达量以内参表达量进行上样量标准化后,以control siRNA作为对照进行归一,采用one-way ANOVA统计方法,根据方差是否齐性选择LSD或者Dunnett T3检验,比较各组mRNA和蛋白表达水平差异显著性。　　 结果:　　 1. 体外MS1细胞转染验证VEGFR2 mRNA及蛋白表达水平筛选高效沉默siRNA序列。　　 1.1 提取转染后48小时MS1细胞总RNA,半定量RT-PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后UV光下拍照,Image J软件扫描分析各组VEGFR2及β-actin条带光密度值,VEGFR2/β-actin条带光密度比值作为VEGFR2 mRNA的相对表达量。采用单向方差分析(one—way ANOVA)方法比较给药各组VEGFR2 mRNA表达水平,显示具有显著性差异(F=20.995,P=0.000),根据方差齐性(P>0.05)采用LSD法进行各组间两两比较。统计结果表明,与control siRNA组的VEGFR2 mRNA表达水平相比,各VEGFR2 siRNA序列所转染的MS1细胞VEGFR2 mRNA表达水平均显著下调,沉默效率分别为:siRNA1,58.6％(P=0.000)；siRNA2,69.7％(P=0.000)；siRNA3,57.2％(P=0.000)；siRNA4,40.5％(P=0.000)。siRNA1(P<0.05)、siRNA2(P<0.01)、siRNA3(P<0.05)沉默效率显著高于siRNA4,siRNA2与siRNA1、siRNA3之间无显著性差异,siRNA1和siRNA3之间无显著性差异。　　 1.2 各组实时定量PCR(Quantitative real time PCR)结果根据公式计算出VEGFR2mRNA表达量,△△Ct=各组△Ct/control siRNA△Ct=(VEGFR2Ct值-GAPDH Ct值)/control siRNA△Ct,各组VEGFR2 mRNA表达量=2^-△△Ct。采用单向方差分析(one—way ANOVA)方法比较给药各组VEGFR2 mRNA表达水平,显示具有显著性差异(F=1325.255,P=0.000),根据方差不齐(P<0.05)采用Dunnett T3法进行各组间两两比较。统计结果表明,与control siRNA组的VEGFR2 mRNA表达水平相比,各VEGFR2 siRNA序列所转染的MS1细胞VEGFR2 mRNA表达水平均显著下调,沉默效率分别为:siRNA1,96.0％(P=0.000)；siRNA2,98.7％(P=0.000)；siRNA3,86.0％(P=0.000)；siRNA4,97.6％(P=0.000)。siRNA1(P<0.05)、siRNA2(P<0.01)、siRNA4(P<0.05)沉默效率显著高于siRNA3,siRNA2的沉默效率与siRNA1、siRNA4之间无显著性差异。　　 1.3 体外MS1细胞转染结束72小时后,提取细胞总蛋白用免疫蛋白印迹(westernblot)方法分析各组VEGFR2蛋白表达水平。用Image J软件扫描得到各组VEGFR2及β-actin条带的光密度值,每组VEGFR2蛋白条带光密度值除以β-actin条带的光密度值即为各组VEGFR2蛋白相对表达量,以control siRNA作为对照进行归一。采用单向方差分析(one-way ANOVA)方法比较给药各组VEGFR2蛋白表达水平,显示具有显著性差异(F=109.438,P=0.000),根据方差不齐(P<0.05)采用DunnettT3法进行各组间两两比较。与control siRNA组的VEGFR2蛋白表达水平相比,siRNA4无显著性差异,而siRNA1(P<0.05)、siRNA2(P<0.01)、siRNA3(P<0.05)VEGFR2蛋白表达水平显著减少。SiRNA2的沉默效率显著高于siRNA1(P<0.05)、siRNA3(P<0.05)和siRNA4(P<0.05)。　　 2. A549人非小细胞肺癌肿瘤移植物裸鼠模型体内肿瘤生长抑制实验,观察小鼠体重、肿瘤体积、生存时间。　　 2.1 每三天检测小鼠体重及肿瘤体积,采用析因方差分析方法比较各组肿瘤体积和荷瘤鼠体重变化,各组间体重有显著性差异(F=5.923,P=0.000)。control siRNA组的体重明显小于PEI组(P<0.01)、saline组(P<0.01)、EGFR2 siRNA+EGFRsiRNA+3mg/kg顺铂组(P<0.01)。EGFR2 siRNA+EGFR siRNA组的体重明显小于saline组(P<0.05)。各组间肿瘤体积有显著性差异(F=57.301,P=0.000),VGFR2siRNA组(P<0.01)、5mg/kg顺铂组(P<0.01)、EGFR siRNA组(P<0.01)、EGFR2siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组(P<0.01)显著减小肿瘤体积。　　 2.2 对荷瘤小鼠生存时间采用Kplan-Meier生存分析,并绘制生存曲线得出各组中位生存时间,利用Log-Rank(Mantel-Cox)(Chi-Square=0.135,P=0.713),Breslow(Generalized Wilcoxon)(Chi—Square=0.400,P=0.527),Tarone-Ware(Chi-Square=0.034,P=0.853)检验各组生存时间无显著性差异。　　 3. 小鼠肿瘤内VEGFR2,EGFR两种基因蛋白表达水平的检测。　　 3.1 肿瘤组织提取总蛋白,进行Western blot检测。Image J软件扫描得到各组VEGFR2、EGFR及β-actin条带的光密度值,每组VEGFR2或EGFR蛋白条带光密度值除以β-actin条带的光密度值即为各组VEGFR2或EGFR蛋白相对表达量,以control siRNA作为对照进行归一。采用单向方差分析(one—way ANOVA)方法比较给药各组EGFR蛋白表达水平(F=126.255,P=0.000),显示具有显著性差异,根据方差不齐(P<0.05)采用Dunnett T3法进行各组间两两比较。跟PEI组相比,VEGFR2 siRNA组(P<0.05),EGFR siRNA组(P<0.05),5mg/kg顺铂组(P<0.05),VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA组(P<0.05),VEGFR2 siRNA+EGFRsiRNA+3mg/kg顺铂组(P<0.05)的EGFR蛋白表达水平均显著减少。EGFR siRNA组的EGFR蛋白表达量显著高于5mg/kg顺铂组(P<0.01),VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA组(P<0.01),VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组(P<0.01)。VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA组EGFR蛋白水平显著高于VEGFR2siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组(P<0.05)。VEGFR2 siRNA的EGFR表达量与EGFR siRNA组、5mg/kg顺铂组,VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA组,VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组间无显著性差异。5mg/kg顺铂组与VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA组,VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组间无显著性差异。　　 3.2 采用单向方差分析(one—way ANOVA)方法比较给药各组VEGFR2蛋白表达水平(F=44.950,P=0.000),显示具有显著性差异,根据方差齐性(P>0.05)采用LSD法进行各组间两两比较。与PEI组相比各组VEGFR2蛋白表达水平均显著减少(P=0.000)。5mg/kg顺铂组的VEGFR2蛋白水平显著低于VEGFR2 siRNA组(P<0.01)、EGFR siRNA组(P<0.05)及VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组(P<0.01)。VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA的VEGFR2蛋白水平显著低于VEGFR2 siRNA组(P<0.05)、EGFR siRNA组(P<0.05)及VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组(P<0.01)。VEGFR2 siRNA组和EGFR siRNA组之间,5mg/kg顺铂组和VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA组之间,VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组与VEGFR2 siRNA或EGFR siRNA组之间均无显著性差异。　　 4. 小鼠肿瘤内VEGFR2,EGFR两种基因mRNA表达水平的检测。　　 4.1 肿瘤组织提取总RNA进行实时定量PCR(Quantitative real time PCR)以检测VEGFR2 mRNA表达情况。采用单向方差分析(one-way ANOVA)方法比较给药各组VEGFR2 mRNA表达水平(F=208.483,P=0.000),显示具有显著性差异,根据方差齐性(P>0.05)采用LSD法进行各组间两两比较。与PEI组相比各组VEGFR2 mRNA表达水平均显著上调,VEGFR2 siRNA组(P<0.05),EGFR siRNA组(P=0.000),5mg/kg顺铂组(P<0.05),VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA组(P=0.000),VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组(P=0.000)。EGFRsiRNA组的VEGFR2 mRNA显著高于VEGFR2 siRNA组、5mg/kg顺铂组、VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA组、VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组(P=0.000)。VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA组显著高于VEGFR2 siRNA组(P<0.05)和5mg/kg顺铂组(P<0.05)。VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组显著高于VEGFR2 siRNA组(P<0.01)和5mg/kg顺铂组(P<0.01)。VEGFR2siRNA组和5mg/kg顺铂组之间,VEGFR2 siRNA+EGFR siRNA组和VEGFR2siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组之间无显著性差异。　　 4.2 小鼠肿瘤内EGFR mRNA表达情况,采用单向方差分析(one-way ANOVA)方法比较给药各组EGFR mRNA表达水平(F=10.704,P=0.000),显示具有显著性差异,根据方差不齐(P<0.05)采用Dunnett T3法进行各组间两两比较。EGFR2siRNA+EGFR siRNA+3mg/kg顺铂组显著低于saline组(P<0.05)、VGFR2 siRNA组(P<0.05)、5mg/kg顺铂组(P<0.05)。　　 结论:　　 1.从mRNA水平和蛋白水平的沉默效率来看,VEGFR2 siRNA2显著高于siRNA1、siRNA3和siRNA4,因而选为后续动物体内抗肿瘤实验序列。　　 2.VGFR2 siRNA组、5mg/kg顺铂组、EGFR siRNA组、EGFR2 siRNA+EGFRsiRNA+3mg/kg顺铂组可抑制肿瘤生长,显著减小肿瘤体积,但各疗法之间无显著性差异。EGFR2 siRNA+EGFR siRNA和control siRNA可引起荷瘤小鼠体重明显减轻。在生存期方面,各组中位生存时间的两两比较没有显著性差异。　　 3.小鼠肿瘤内VEGFR2,EGFR两种基因表达水平的检测揭示了各组抗肿瘤的分子机制是由于直接和/或间接减少了VEGFR2,EGFR两种基因蛋白表达水平。　　 4.靶向VEGFR2和EGFR的siRNA联合化疗药物可减少化疗药物的使用,增强肿瘤生长抑制作用,减少副作用,延长生存时间。