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M23家族蛋白酶具有内肽酶和酰胺酶活性,能降解细菌细胞壁肽聚糖,作为新型的蛋白类抗生素倍受关注。部分噬菌体裂解酶属M23家族蛋白酶,能高效地裂解多重耐药性细菌,使其有望应用于取代传统的抗生素治疗。本文在已获得腾冲热海栖热菌噬菌体TSP4基因组的基础上,分析此噬菌体裂解酶基因的基本特征,对裂解酶基因进行克隆表达,同时探索利用高温酶热稳定性高的特点,建立基于菌体热裂解的重组裂解酶快速纯化方法,并通过抑菌活性和AFM观察评价纯化后裂解酶的活性。最后将裂解酶用可溶性淀粉吸附制备成酶制剂,定期评价酶制剂的酶活变化。为了探索裂解酶的裂解机理,本文分别利用革兰氏阴性菌大肠杆菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的肽聚糖,与裂解酶进行反应,研究其对肽聚糖的吸附特征,通过液质联用分析裂解酶水解肽聚糖的位点,并进一步通过对裂解酶基因的定点突变,验证裂解酶的活性位点及特征。为了探索裂解酶的抑菌效果,本文通过致死率分析及电镜观察,评价裂解酶对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和多重耐药肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果。并通过在小鼠身上制造了皮肤伤口,定殖耐药金黄色葡萄球菌随后用TSPpgh对局部进行治疗,探索裂解酶在治疗多重耐药金黄色葡萄球菌在外伤感染中的作用。结果表明,栖热菌噬菌体TSP4裂解酶TSPpgh属于M23肽酶家族,推测motif HXXXD和HXH为TSPpgh的活性位点,并进行了突变验证。将裂解酶基因TSPpgh克隆表达后,得到分子量19 KDa的重组蛋白。通过对诱导表达后的发酵液升温至55℃并维持20分钟,能使细胞破裂并变性沉淀去除掉绝大多数表达菌株大肠杆菌的蛋白,从而实现裂解酶的快速纯化,结合高密度发酵技术,发酵液中裂解酶浓度可达2 mg/mL。裂解酶对金黄色葡萄球菌ATCC 6538的杀菌效率最高,可达90%。通过AFM观察表明,TSPpgh裂解了大肠杆菌BL21(含TSPpgh质粒)和金黄色葡萄球菌的细胞壁,制备的酶制剂在20℃保存一年其酶活能保持75%。裂解酶TSPpgh能够吸附和水解革兰氏阴性菌和阳性菌的肽聚糖,并且能够水解弹性蛋白。通过液质联用分析TSPpgh水解肽聚糖的位点表明,TSPpgh还能够水解糖苷键Glcp-β-1’-6’-Glcp-β-1’-1’,具有糖苷酶的活性。抑菌实验表明,TSPpgh在37℃、酶浓度为68μg/mL的浓度下,裂解酶TSPpgh对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌CMCC(B)50094和大肠杆菌CMCC(B)44102菌株的致死率达90%,对多重耐药肺炎克雷伯氏菌的致死率高达80%以上,部分致死率可达100%;通过SEM观察表明,裂解酶TSPpgh通过裂解作用而实现其杀菌功能。本研究在小鼠身上制造了皮肤伤口,定殖耐药金黄色葡萄球菌2612-1606BL1486,随后用TSPpgh对局部进行治疗。在为期9天的治疗期间,TSPpgh和卡那霉素均快速的促进了伤口愈合。验证了裂解酶TSPpgh在治疗多重耐药金黄色葡萄球菌在外伤感染中的作用。本文建立了高温裂解酶的高效表达和快速纯化方法,结合此裂解酶较广泛的细菌裂解谱、较高的裂解酶活性以及热稳定性,使其具有较好的生产应用前景,其对多重耐药菌良好的杀灭效果,有助于其作为新型的酶抗生素应用于医药研发。