黑曲霉ATCC 20611（Aspergillus niger ATCC 20611）是低聚果糖合成的主要工业生产菌株,其分泌的β-呋喃果糖苷酶（FopA）是负责将蔗糖转化为低聚果糖（1F-低聚果糖）的关键酶。该酶受蔗糖诱导且是黑曲霉ATCC 20611的主要分泌蛋白,因此其启动子（PfopA）是该菌株的天然强启动子。FopA催化蔗糖转化合成低聚果糖过程中,低聚果糖占比一般在55%左右,提升低聚果糖纯度一直是黑曲霉ATCC 20611菌种改良的重要方向。同时,蔗糖是廉价易得碳源,所以开发该菌作为蛋白表达系统也具有重要应用价值。因此,充分利用PfopA启动子进行菌种改造将有助于实现低聚果糖产率提升并建立高价值蛋白表达体系。本论文以黑曲霉ATCC 20611为研究对象,利用其自身启动子PfopA表达不同来源蛋白对菌株进行改造尝试。首先,利用PfopA表达红发夫酵母的6G-β-呋喃果糖苷酶（Xd-INV）,该酶可催化合成功效更强的新型低聚果糖——新科斯糖（6G-低聚果糖）,从而优化低聚果糖产物;其次,利用PfopA表达葡萄糖氧化酶（GOX）和过氧化物酶（POD）,以消耗低聚果糖生产过程中的副产物葡萄糖,提高低聚果糖纯度;最后,利用PfopA表达动物源性抗菌肽尝试构建抗菌肽的蔗糖诱导型黑曲霉表达分泌系统。具体研究内容如下:（一）利用PfopA启动子在黑曲霉ATCC 20611中表达红发夫酵母Xd-INV。首先,采用基因置换型策略进行表达,即将Xd-INV基因表达盒利用定位整合方式替换黑曲霉基因组的FopA基因位点,在敲除FopA基因的同时利用基因组位点的PfopA启动子进行Xd-INV单独表达,产物仅合成新科斯糖。Xd-INV融合FopA的C-端结构域（负责细胞壁锚定）的转化株命名为IFC,融合米曲霉细胞壁锚定蛋白MP1的转化株命名为IMP。经基因组PCR和葡萄糖平板检测分析表明,IFC和IMP两种菌株均构建成功,且发酵时菌丝体最高酶活分别达到146.53 U/g和90.93 U/g。新科斯糖合成实验发现,IFC菌株的产率高于IMP菌株,含量为19.08%。为了进一步提升低聚果糖合成效率,将Xd-INV基因表达盒利用随机插入基因组方式进行遗传转化,这样在表达Xd-INV的同时也保留了原有的FopA,可生产普通型低聚果糖（1F-低聚果糖）与新科斯糖（6G-低聚果糖）混合物。融合FopA C-端结构域的转化株命名为IFCF,而融合MP1的转化株命名为IMPF。低聚果糖合成实验发现,IFCF菌株低聚果糖产量达到62.59%,而IMPF菌株低聚果糖产量也达到了 58.30%。因此,利用PfopA在黑曲霉ATCC 20611中表达红发夫酵母Xd-INV获得成功,并优化了低聚果糖成分。（二）利用PfopA在黑曲霉ATCC 20611中表达GOX和POD。低聚果糖合成过程中也产生30%左右的副产物葡萄糖,因此利用PfopA表达GOX和POD可以消耗葡萄糖,有助于提高低聚果糖纯度。首先,利用PfopA启动子和FopA信号肽序列构建了来源于黑曲霉ATCC 1015的GOX表达盒转化黑曲霉ATCC 20611和ΔfopA菌株（该菌缺失基因fopA不表达β-呋喃果糖苷酶）,转化株分别命名为GOD和DGOD。菌株发酵后GOX活力主要存在于发酵液上清中,且DGOD转化株酶活（22.97 U/g）高于GOD转化株（6.05 U/g）。为了使GOX与FopA同样定位于细胞壁以方便低聚果糖合成优化,将GOX与FopA的C-端结构域融合起来构建菌株,命名为GOF。GOF的GOX活力主要存在于细胞壁达到29.30 U/g,合成低聚果糖产物纯度由出发菌株的50.10%提高到60.63%。然后,利用PfopA表达来源于辣根的POD,采取POD与FopA融合方式（中间用Kex2酶切位点连接）构建表达盒转化黑曲霉ΔfopA,转化株命名为DPOF。DPOF在葡萄糖检测平板上菌落周围显现红色晕圈,而出发菌株ΔfopA不出现晕圈,且发酵后的POD活力达到5.10 U/g,其菌丝体FopA活力也达到252.60 U/g。由此表明,PfopA启动子驱动下的FopA与POD融合表达成功。进一步,利用PfopA将POD与FopA的C-端结构域融合进行表达以使POD定位于细胞壁。由此构建的表达盒转化黑曲霉ΔfopA,转化株命名为DPOC。DPOC的菌丝体POD活力可达7.70 U/g,而该菌株与共表达GOX和FopA的GOF菌株进行低聚果糖合成实验,结果表明低聚果糖合成纯度达到71.26%,实现了低聚果糖成分优化。另外,本研究也进行了 PfopA同步表达GOX和POD的尝试。将GOX表达盒（仅含FopA信号肽）和POD-FopA融合表达盒共转化黑曲霉Δfop.4,转化株命名为DGP。转化株发酵液中均检测到GOX和POD酶活力,分别达到49.24 U/g和3.73 U/g。该胞外分泌型表达的GOX和POD为获得纯化酶进行低聚果糖优化奠定了基础。总之,本章利用PfopA成功表达了不同分泌方式的GOX和POD,实现了黑曲霉ATCC 20611的菌种改良并促进了低聚果糖的合成优化。（三）利用PfopA在黑曲霉ATCC 20611中表达动物源性抗菌肽菌株的构建。首先,利用PfopA启动子和FopA信号肽序列分别构建了牛乳铁蛋白肽（LFcinB）、牛乳铁蛋白肽衍生物（LFcinB3）和天蚕素AD（Cecropin AD）三种抗菌肽的表达盒（表达盒携带抗性筛选标记）,然后转化黑曲霉ATCC 20611,转化株分别命名为LFB、LFB3和CAD。经抗性平板筛选和基因组PCR分析,三类转化株均验证成功。同时,为了便于转化株筛选和蛋白分泌,三种抗菌肽也与FopA融合进行表达,然后直接转化黑曲霉ΔfopA。LFcinB转化株命名为LKF（融合蛋白顺序为LFcinB-FopA）和FKL（融合蛋白为FopA-LFcinB）;LFcinB3转化株命名为L3KF（融合蛋白为LFcinB3-FopA）和FKL3（融合蛋白为FopA-LFcinB3）;Cecropin AD转化株命名为CAKF（融合蛋白Cecropin AD-FopA）和FKCA（融合蛋白FopA-Cecropin AD）。经抗性平板筛选、葡萄糖检测平板筛选以及基因组PCR分析,此三类转化株也均验证成功。最后,经抗菌肽基因转录分析,分别获得LFcinB、LFcinB3和Cecropin AD相关转化子4株、4株和3株。这些PfopA表达抗菌肽菌株的初步构建成功,为后继抗菌性能分析奠定了基础。