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甘蔗田杂草危害严重,给甘蔗产业的发展造成严重的损失。利用基因工程技术改造甘蔗的遗传特性,使其对除草剂具有抗性,从而在蔗田施用化学除草剂时不影响甘蔗的正常生长,可以有效降低劳动强度,提高工效,减少成本开支,社会及经济效益明显。为了获得耐草甘膦的抗性植株,本试验对粤糖00-236、粤糖93-159、新台糖22号的组织培养体系进行了优化,并对农杆菌介导的遗传转化技术参数作了探索,同时将经过优化的、具有我国自主知识产权的草甘膦抗性基因aroAMl,通过农杆菌介导法转入优良甘蔗品种粤糖00-236,主要获得了以下结果:
1、优化了甘蔗愈伤组织培养体系
(1)2,4-D浓度对甘蔗愈伤组织的诱导具有重要影响,甘蔗外植体接种到MS+2,4-D2.0~3.0 mg/L+30 g/L蔗糖+10 g/L琼脂,pH5.8的愈伤诱导培养基,三个品种的甘蔗的愈伤诱导率较好,其中粤糖00-236在2,4-D浓度2.5 mg/L时的诱导率最高。(2)在MS+2,4-D2.5mg/L+30 g/L蔗糖+10 g/L琼脂的愈伤诱导培养基中添加椰子汁,可以提高粤糖00-236的愈伤诱导率,但是另两个品种却没有比对照表现的更好。(3)在不改变激素配比的情况下,改变蔗糖的用量,对组培苗的生根具有很大影响,在不添加蔗糖的生根培养基中,组培苗不能生根,后期枯死,在培养基中添加蔗糖50g/L时,三个品种生根情况较好,均表现出平均根数较多,根长较长。(4)对组培生根苗进行假植时,选用砂壤土为土壤基质时假植的成活率高。同时发现在生根培养基中添加多效唑,有促进再生苗生根的作用。
2、探索了甘蔗农杆菌遗传转化的技术参数
对粤糖00-236进行遗传转化时,采用超毒农杆菌菌株EHA05,克服了材料对农杆菌的不敏感性;使用OD600=1.0时的工程菌液浓度进行侵染,共培养3天后,转入含有草甘膦0.08 mmol/L、头孢霉素400mg/L的分化培养基上进行筛选培养,诱导胚状体出芽,经过5代的筛选,最大程度的减少假阳性转化苗的产生;在诱导农杆菌的Vir基因表达时,使用100μmol/L的乙酰丁香酮(AS),以促进T-DNA的转移。
3、获得25个瓶苗时期对草甘膦具有耐受性的转化株系
本研究对转化的甘蔗胚性愈伤组织,经草甘膦抗性筛选,获得25个瓶苗时期对草甘膦具有耐受性的转化株系。对其中的4个株系进行了分子鉴定,其系列再生苗PCR的检测结果大部分呈阳性,进一步的Southern Blot杂交结果显示,其中一个株系含有两拷贝aroAM1基因序列。初步断定获得了转基因的阳性植株,为下一步的试验奠定了基础,另外21个株系的瓶苗在进一步的培养中。