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目的:研究主要针对实验室前期在非综合征性耳聋(Non-syndromic Hearing Impairment,NSHI)患者中筛查得到的GJB2(Gap junction protein,beta 2)基因新发突变位点进行细胞表达及定位研究,并通过分子建模预测突变对蛋白结构造成的影响,以分析这些突变位点的致病性并初步探究致病位点的分子遗传学机制。方法:首先通过生物信息学预测GJB2基因新发突变位点的致病可能性,对物种保守性较高且致病可能性高的突变建立细胞模型进行致病性研究:针对野生型GJB2基因及各突变体(p.W24R、p.V43L、p.Q57H、p.H67N、p.M93V)构建GFP标签的融合表达载体,同时构建了3个已经报道过的明确致病的突变体(p.M34T、p.T55N、p.S85P)一同进行研究;将构建质粒转染HEK 293T细胞和HeLa细胞,蛋白质免疫印迹分析蛋白的表达情况,免疫荧光技术观察野生型(WT)与突变型(MT)蛋白细胞定位的差别,细胞定位显示与野生型蛋白呈现明显区别的突变体进一步明确其亚细胞定位情况;然后利用在线软件Swiss-Model和蛋白结构查看软件PDB-Viewer预测分析突变所致蛋白构象改变可能对间隙连接通道造成的影响;最后构建共表达载体以便日后对目的蛋白的功能及突变蛋白的致病机制进行进一步研究。结果:1.生物信息学对p.W24R、p.V43L、p.Q57H、p.H67N、p.M93V、p.I107V突变体分析结果显示:除p.I107V突变以外其余突变体的物种保守性都比较高且致病可能性大;2.通过定点突变技术成功构建了GJB2基因的8个突变型融合表达载体,Western Blot结果显示,p.W24R突变蛋白与野生型蛋白相比分子量稍小,可能是突变使蛋白发生了某种修饰或者正常分子量蛋白发生了异常降解,其余突变蛋白的分子量大小与野生型基本相同;细胞定位结果显示,p.M34T、p.V43L、p.Q57H、p.H67N、p.S85P、p.M93V突变蛋白与野生型蛋白相似,定位在细胞膜上,而在表达p.W24R、p.T55N的HeLa细胞中,并未看到类似于野生型蛋白的细胞定位情况,突变蛋白弥散在细胞质中与内质网的定位一致;3.针对新发突变构建的蛋白模型显示,p.W24R、p.V43L、p.H67N、p.M93V突变可能会破坏半球通道的稳定或者影响半球通道的形成,而p.Q57H则可能通过影响半球通道之间的相互作用导致间隙连接通道形成受损;4.成功改造pEGFP-N1载体为IRES-mCherry双顺反子载体,并成功构建GJB2(WT/MT)-IRES-mCherry共表达载体以便后续研究。结论:GJB2基因p.W24R突变与遗传性感音神经性耳聋相关,该突变可能通过改变Cx26在细胞内的转运,使Cx26在细胞质中累积,阻止功能性Cx26间隙连接的形成,从而导致耳蜗间隙连接功能障碍和听力损失。