抗人前列腺干细胞抗原抗体的制备 及其在前列腺癌诊断治疗中的应用研究 前列腺干细胞抗原(PSCA,prostate stem cell antigen)是 Reiter 等于 1998 年用特征性差异分析的方法在人前列腺癌动物模型 LAPC-4 鼠中发现的一个 前列腺癌相关肿瘤抗原。因为它与干细胞抗原 2(SCA-2, stem cell antigen 2) 30%同源而被命名为前列腺干细胞抗原。属于 Thy-1/Ly-6 家族的葡糖磷酯酰肌醇 (GPI)锚定的细胞表面抗原成员之一。研究表明 PSCA 具有很高的前列腺组织特异 性;在激素依赖和激素非依赖前列腺癌以及前列腺癌骨转移灶标本中均有高表达。 PSCA 有可能成为前列腺癌早期诊断、免疫治疗和靶向治疗的一个理想靶抗原。本 研究制备了抗人前列腺干细胞抗原抗体,用于前列腺癌的病理诊断,并观察其对 裸鼠前列腺癌移植瘤生长抑制的影响。 第一部分 人前列腺干细胞抗原的克隆及表达 从培养的人前列腺癌细胞株中提取总 RNA,反转录成 cDNA,通过 PCR 方法扩 增包含蛋白融合点的 PSCA 基因片段,经 DNA 测序证实后克隆至带有 Trx.His 标签 的原核表达载体 pET32a,重组质粒转化大肠杆菌,IPTG 诱导表达,SDS-PAGE 分 析表达结果,经 Ni-NTA 树脂亲和纯化蛋白。PCR 扩增得到 241bp 的目的片段,序 列测定证实与 Genebank 上登录的序列一致;成功构建了 PSCA 基因片段的原核表 达载体 pET32a-PSCA;在大肠杆菌中表达,于 Mr20.4×103处有一蛋白新生带。融 合蛋白经纯化后纯度达到 90%。 第二部分 抗人前列腺干细胞抗原多克隆抗体的制备 经 Ni-NTA 树脂亲和纯化的蛋白 PSCA,皮下多点注射免疫小鼠;收集免疫小 鼠的血清,经 ELESA 确认抗血清的滴度>1∶4000。ELISA 检测与正常血清对照比 6<WP=9>01 级博士论文 抗人 PSCA 单抗的制备及其在 PCa 诊断治疗中的应用研究 中文摘要 较,提示接受融合蛋白免疫的小鼠产生了较高滴度的血清,说明基因重组的 PSCA 融合蛋白对小鼠具有免疫原性。免疫组化染色结果显示在前列腺癌上皮细胞可见 棕黄色阳性染色。阴性对照着色不明显。 第三部分 抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的制备 以纯化的前列腺干细胞抗原(PSCA)为抗原免疫 Balb/c 小鼠,含阳性血清的小 鼠脾细胞与 SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞融合,经 HAT 选择性培养基克隆化培养,用间 接 ELISA 方法重复筛选后,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。本研究筛选出 1 株杂 交瘤细胞株 D3。将培养上清液浓缩后进行亚类鉴定,该株细胞为 IgG1。抗人 PSCA 单抗特异性经 Western blot、ELISA、免疫组化(IHC)证实,它们均能特异识别 PSCA,与其它因子无交叉反应。 第四部分 抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体在前列腺癌病理诊断中的应用 采用 EnVisionTM 两步免疫组织化学染色法,抗人 PSCA 单抗检测正常前列腺、 前列腺增生(BPH)、前列腺癌、膀胱、肾等组织,免疫组化结果显示,大多数前 列腺癌以及激素非依赖型前列腺癌 PSCA 染色均呈中度到强度染色,少部分染色较 浅,染色范围:多数 50%～100%肿瘤细胞着色,与前列腺增生及正常前列腺组织 相比,染色强度及范围在前列腺组织中差异较明显,所有前列腺癌转移组织均呈 范围广泛的 PSCA 强表达。 第五部分 前列腺癌动物模型的建立 培养前列腺癌雄性激素非依赖株 DU145,收集细胞并计数,行裸鼠背部皮下 注射,每只注射 2×106/0.2ml,裸鼠皮下接种成瘤率 83%,制成小鼠前列腺癌移 植瘤皮下种植模型。成瘤后摘取皮下移植瘤,切成小块,接种于小鼠前列腺背侧 叶,原位种植成瘤率 90%,局部有转移,建成小鼠前列腺癌移植瘤原位种植模型。 裸鼠前列腺癌移植瘤原位模型是研究前列腺癌发病机理的理想模型。 第六部分 抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体对前列腺癌治疗的体外实验 7<WP=10>01 级博士论文 抗人 PSCA 单抗的制备及其在 PCa 诊断治疗中的应用研究 中文摘要 观察抗人 PSCA 单抗对荷瘤小鼠前列腺癌的生长的影响。BALB/c 小鼠 12 只, 接种前列腺癌细胞株 DU145 后,随机均分为 3 组,其中 1 组于接种后每周三次连 续两周腹腔注射抗人 PSCA 单抗;1 组于接种后每周三次连续两周行肿瘤瘤周皮下 注射抗人 PSCA 单抗,另以磷酸盐缓冲液(PBS)腹腔注射作阴性对照组,接种后 第 56 天处死小鼠并称取瘤重,计算抑瘤率,并做组织病理学检查。结果显示抗人 PSCA 单抗瘤周皮下注射及腹腔注射单抗均可抑制前列腺癌移植瘤的生长,瘤周皮 下注射抗体效果优于其他组。提示抗人 PSCA 单抗具有良好的临床应用前景。 综上所述,PSCA 具有前列腺高度的组织特异性,与前列腺癌的发生发展以及 转移相关, PSCA 是一种很有前途的用于前列腺癌早期诊断和治疗的特异性瘤标。 我们制备的抗人 PSCA 的单克隆抗体,可用于前列腺癌的病理诊断;通过前列腺癌 动物模型观察到单抗对前列腺癌移植瘤的生长抑制的影响。本研究对前列腺癌新 瘤标 PSCA 在诊断治疗的应用基础方面做