结直肠癌是消化道中常见的恶性肿瘤。据统计,在美国的男性和女性中,结直肠癌在恶性肿瘤的发病率和死亡率都位居前三位。我国每年新发结直肠癌病例为33.1万人,死亡15.9万人。转移仍然是患者致死的主要原因。目前,对于远处转移的结直肠癌患者的治疗仍以化疗为主。尽管许多分子靶向药物已被美国食品药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于转移性结直肠癌的辅助治疗,但因个体差异,治疗效果差别很大。因此,研究结直肠癌的转移机制,并且寻找新的分子靶向标志物,成为结直肠癌的治疗和提高患者生存质量的重点。上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Tansition,EMT)是指上皮细胞向间质细胞转换的过程。EMT帮助细胞获得更强的运动和转移能力,是肿瘤转移的主要模式之一。EMT的发生受到细胞内外复杂交错的信号通路调控。肿瘤细胞自身以及其周围环境中的间质细胞,分泌TGF-β等因子,通过与细胞表面的受体结合后激活下游通路,从而进一步活化核内转录因snail、ZEB1、twist等,调节EMT相关分子的表达。TGF-β信号通路是EMT的关键调控因子和主要诱导因子,其在发育、伤口愈合、纤维化和肿瘤中发挥重要的作用。TGF-β等EMT诱导因子,不仅来源肿瘤本身,更受到肿瘤周围微环境的影响。肿瘤微环境是肿瘤细胞生活的内环境,其中不仅包括了周围的成纤维细胞、免疫细胞和炎性细胞等各种细胞,同时也包括附近区域内的细胞间质、微血管以及分散在其中的生物分子。肿瘤微环境对EMT的发生起到重要调节作用,然而具体调控机制十分复杂且尚未明确。在肿瘤细胞向深部浸润和转移时,侵袭前缘被认为是EMT发生的热点区域。在侵袭前缘,存在一种特殊类型的肿瘤细胞,他们通常脱离肿瘤主体,类似出芽方式呈现单个细胞或聚集成不多于五个细胞的细胞团,称为肿瘤芽。肿瘤芽被认为是肿瘤细胞发生EMT的典型表现。为了研究不同部位的肿瘤微环境对肿瘤EMT和转移的调控机制的影响,我们实验室前期研究通过将结直肠癌组织分成肿瘤主体和侵袭前缘两部分,再应用显微微切割技术分别捕获肿瘤芽细胞、肿瘤芽周围间质细胞、肿瘤主体细胞、肿瘤主体间质细胞以及正常上皮细胞和间质细胞六大类。经过表达谱芯片分析和计算后,发现一系列差异表达基因,S100A8基因就是其中之一,提示S100A8可能影响结直肠癌细胞的EMT和转移。S100A8蛋白又称Mrp8或CalgranulinA,是S100钙结合蛋白家族成员之一。许多肿瘤组织如乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、胃癌和肺癌等,肿瘤细胞及其周围浸润的免疫细胞中S100A8的表达明显上调。而S100A8在肿瘤组织中的差异性表达以及抗肿瘤和促肿瘤的双重作用,导致S100A8与肿瘤的关系十分复杂。目前多数研究集中在S100A8作为分泌蛋白作用于肿瘤细胞的功能,而对于S100A8蛋白本身在肿瘤细胞内的功能研究缺乏。经过与结直肠癌转录组数据库比对,发现TGF-β升高的结直肠癌患者,S100A8水平也相应增加。在结直肠癌中,S100A8蛋白具体表达在哪些细胞?哪些胞外信号可以调控肿瘤细胞表达S100A8?TGF-β与S100A8有何关系?胞内S100A8的表达与EMT关系如何?这些问题都有待研究。USF上游转录因子(upstream transcription factor),是广泛存在于真核生物中的转录因子,USF家族蛋白包括USF1和USF2。USF2能形成二聚体与靶基因启动子上的E-box结合调节转录。USF2与肿瘤EMT的关系尚未见报道。已有文献表明肿瘤细胞分泌的TGF-β可以通过上调USF2诱导间质树突细胞产生T细胞免疫球蛋白黏蛋白β(TIM3)。另外,在肾纤维化中,抑制USF2的DNA结合能力能显著降低TGF-β诱导的纤维蛋白溶酶原活化抑制剂-1(PAI-1)转录,后者正是促进肾纤维化的重要分子,而EMT是纤维化的重要机制之一。因此TGF-β是否可以通过调节USF2的转录活性而影响EMT?USF2的转录活性是否又能调节S100A8的表达,从而促进EMT发生?首先我们通过免疫组织化学方法对结直肠癌组织进行染色、观察和统计。为了明确S100A8在微环境和肿瘤细胞内的具体意义,将免疫组织化学染色的结果按照肿瘤间质细胞和肿瘤实质细胞区分,分别统计S100A8在间质和实质表达,将统计结果与患者的生存以及EMT相关指标进行分析。接着应用人重组蛋白S100A8模拟肿瘤细胞外间质环境,处理结直肠癌细胞系,检测EMT标志物的表达改变及细胞运动能力改变。在肿瘤细胞内,将S100A8和USF2分别过表达和敲低,检测EMT标志物和细胞生物学行为。体内实验采用小鼠尾静脉肺部转移瘤实验,明确S100A8对转移的影响。此外应用染色质免疫共沉淀和荧光素酶报告基因方法,探索USF2的转录活性对S100A8的调控。免疫组织化学结果提示S100A8主要表达在肿瘤间质的中性粒细胞和单核细胞中。对肿瘤间质主体和侵袭前缘的S100A8阳性细胞分别计数后,发现肿瘤侵袭前缘S100A8密度越高,患者生存时间越长;而肿瘤主体S100A8密度与患者的生存无明显相关。同时肿瘤侵袭前缘S100A8密度越高,患者的淋巴结转移越少(p<0.001),TNM分期越低(p=0.002),组织学级别越低(p<0.001),脉管侵犯越少(p<0.001)。为了探究间质中S100A8改善结直肠癌患者预后的原因。我们用重组S100A8蛋白模拟间质中S100A8,按照浓度梯度给予结直肠癌细胞SW480和DLD1刺激。发现高浓度S100A8降低肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。Western blot结果显示上皮标志物钙黏蛋白(E-cadherin)表达上升,间质标志物波形蛋白(Vimentin)表达下降,转录因子snail表达下降,同时抗凋亡蛋白Bc12表达下降,说明S100A8阻止细胞发生EMT,诱导细胞凋亡。肿瘤芽是EMT典型形态学标志,因此我们统计了侵袭前缘肿瘤芽的个数,与间质S100A8阳性细胞密度高改善患者预不同,肿瘤芽级别越高,患者生存越差。因此将S100A8与肿瘤芽指标联合后得到新指标SATB(S100A8+-associated Tumor bud),发现SATB分数越高(S100A8阳性个数越少、肿瘤芽个数越多),患者生存越差。多因素COX比例风险模型分析得到SATB能够独立判断患者预后。明确了肿瘤间质中S100A8阳性细胞的生物学意义后,我们探讨了肿瘤细胞本身S100A8表达与预后的关系。在肿瘤实质细胞中S100A8阳性表达组的患者淋巴结转移(p=0.029)和远处脏器转移(p=0.021)更多,TNM分期(p=0.013)更高,生存率(p=0.039)越低,而与患者的性别、年龄、组织学分化和脉管侵犯无关(p>0.05)。S100A8阳性组病人生存差于S100A8阴性组。EMT的诱导因子TGF-β诱导SW480细胞发生EMT的同时,S100A8表达增加。选取SW480和HCT8细胞过表达以及DLD1和HT29细胞敲低S100A8。S100A8过表达组,细胞迁移和侵袭能力增强,细胞发生EMT;而在敲低组结果相反,证明S100A8可以诱导EMT,促进转移。小鼠尾静脉肺部转移瘤实验证实S100A8过表达促进小鼠肺转移灶形成。为了进一步研究S100A8促进肿瘤细胞迁移和侵袭的作用是否依赖TGF-β,用TGF-β刺激已敲低S100A8的DLD1和HT29细胞,与对照组相比TGF-β促进细胞迁移和侵袭的作用减弱。为了阐明S100A8的调控机制,首先通过软件预测,表明上游转录因子2(Upstream Transcription Factor 2,USF2)可以结合 S100A8 启动子(AACACGTGTCC)序列,ChIP实验证实USF2可以结合该启动子序列,荧光素酶报告基因结果表明USF2可以增加该启动子活性,而突变该启动子序列后报告基因信号明显减低。在SW480和HCT8细胞中过表达USF2后S100A8表达增加,细胞发生EMT;在DLD1和HT29中敲低USF2后S100A8表达下降,细胞不发生EMT。重组蛋白S100A8刺激肿瘤细胞发现,核内USF2表达下降,S100A8的表达也下调;而TGF-β刺激肿瘤细胞,核内USF2表达上升,S100A8的表达也上调。为了探索USF2是否调控S100A8细胞内外功能转变,我们在USF2对照和过表达组分别用S100A8刺激,与未刺激相比,USF2过表达组细胞发生的EMT不能被重组蛋白抑制,凋亡也不能被诱导。在USF2空白和敲低组分别用TGF-β刺激后,敲低组EMT不能被诱导。以上结果说明,USF2在细胞外S100A8抑制EMT和细胞内S100A8促进EMT中扮演重要调节作用。基于以上实验结果我们得出以下结论:肿瘤微环境中的S100A8抑制肿瘤细胞EMT发生,S100A8阳性细胞密度越高,患者预后越好。在结直肠癌细胞内,S100A8诱导肿瘤细胞发生EMT,促进细胞转移,肿瘤细胞内S100A8表达患者预后不良。USF2调控S100A8的表达,在肿瘤实质与间质中的S100A8功能转换起到重要调节作用。