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目的：在体外获取交配后(days postcoitum,dpc)3.5d的小鼠胚胎并采用不同的培养体系培养,观察小鼠胚胎的生长状况,初步筛选合适的胚胎体外培养体系：通过免疫细胞化学方法检测生殖细胞核因子(germ cell nuclear factor,GCNF)和Oct-4在小鼠胚胎细胞中的表达。在体外分离、培养小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),应用成骨诱导剂诱导其向成骨细胞表型转化。通过RT-PCR和间接免疫荧光染色,从mRNA和蛋白水平观察GCNF和Oct-4在BMSCs诱导分化前后的表达,并比较GCNF和Oct-4在小鼠胚胎细胞和BMSCs中的表达情况,为进一步研究GCNF在BMSCs增殖分化中的作用以及探讨小鼠BMSCs诱导分化调控机制提供研究思路。
方法：采用超数排卵的方法处理BALB/c小鼠,在3.5dpc取其胚胎,将获得的胚胎采用微滴培养法、与小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonal fibroblast cell,MEF)共同培养法和与3T3细胞共同培养法进行培养。在倒置显微镜下连续观察不同培养体系中小鼠胚胎的生长状况。通过免疫细胞化学方法检测GCNF和Oct-4蛋白在小鼠胚胎中的表达。
采用全骨髓贴壁筛选法体外培养、扩增小鼠BMSCs。以CD29和c-Kit作为BMSCs的表面标志对BMSCs进行鉴定。取第3代小鼠BMSCs,用含10％FBS,0.1μmol/L地塞米松,50μg/ml维生素C和10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基定向诱导BMSCs向成骨细胞分化,通过检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)鉴定诱导后的成骨细胞。采用RT-PCR及间接免疫荧光染色方法,从mRNA和蛋白水平检测GCNF和Oct-4在小鼠BMSCs诱导分化前后的表达。
结果：微滴培养法培养的胚胎几乎不能贴壁且发育迟缓,胚胎内细胞破碎：以MEF和3T3为饲养层细胞的培养体系中胚胎生长良好,可以孵化山透明带,脱落的透明带呈空壳状。免疫细胞化学结果显示,在小鼠早期胚胎细胞中只表达Oct-4而不表达GCNF。
小鼠BMSCs接种24h后已大量贴壁并伸展开；48h后贴壁细胞明显增多并分裂增殖,贴壁细胞呈梭形的成纤维细胞样形态,大小均一。传代培养细胞形态更加均一,增殖加快,呈涡旋样生长。BMSCs在成骨诱导条件下诱导4d后细胞形态开始变化,随着诱导时间的延长,细胞逐渐增大,细胞形态由长梭形逐渐变为多角形,具有多个突起。诱导10d后大多数细胞呈AKP阳性反应。RT-PCR结果与间接免疫荧光染色结果同时显示,第3代的小鼠BMSCs和向成骨方向诱导10d后的BMSCs均有GCNF和Oct-4表达。
结论：(1)首次观察到GCNF在BMSCs增殖分化中有表达；(2)GCNF在BMSCs中的表达模式与在小鼠胚胎细胞中的表达模式不同,提示GCNF在小鼠胚胎细胞和BMSCs中的作用可能不同：小鼠胚胎细胞和BMSCs的分化机制可能不同。