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一、研究背景及目的肝细胞癌(简称肝癌),是世界上第六大常见肿瘤,在全球癌症死亡率中排名第三,正严重威胁着人类健康。针对于晚期肝癌患者,口服索拉非尼仍是最好的治疗手段。众所周知,索拉非尼是一种酪氨酸激酶抑制剂(atyrosine kinase inhibitor,TKI),在肿瘤中有多个作用靶点。自2007年起便成为晚期肝癌患者的一线治疗,能显著提高患者的总生存率(overall survival,OS)。但是由于部分患者对索拉非尼产生了耐药而疗效不佳。索拉非尼耐药的相关通路主要有:Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/AKT、JAK/STAT通路。目前仍未出现有效药物能解决此难题。ETV4,ETS translocation variant 4,又称为PEA3或El AF,是ETS家族成员之一,其他成员主要有ETV1、ETV5。ETV4是蛋白编码基因,在多种癌症中都具有高表达的特征,如前列腺癌、乳腺癌、肝癌等。ETV4是K-Ras及MET通路的下游作用因子,这亦极大地提示ETV4可能与索拉非尼的耐药相关。为了进一步探索肝癌索拉非尼耐药问题,提高索拉非尼的疗效是目前最为紧迫的临床需求。二、研究方法及内容1、ETV4在肝癌中的表达情况及对肝癌患者预后的影响。利用了 TCGA数据集以及11对肝细胞组织标本明确ETV4在肝细胞癌中的mRNA表达情况,分析ETV4与肝癌患者的预后关系。2、探讨ETV4在肝癌中的生物学功能。通过GSEA基因富集分析方法分析ETV4在肝癌中可能参与的生物学过程,并利用体外细胞培养以及western blot蛋白印迹法检测肝癌细胞中ETV4经索拉非尼及顺铂刺激后表达的改变情况。3、探讨ETV4在肝癌中索拉非尼及顺铂产生耐药的作用。采用了体外细胞培养以及western blot蛋白印迹法检测ETV4对肝癌索拉非尼及顺铂诱导的细胞凋亡比例的改变。通过EdU细胞增殖检测法检测ETV4对肝癌细胞在索拉非尼及顺铂刺激下细胞增殖速率的影响。4、探讨ETV4促进肝癌细胞对索拉非尼及顺铂产生耐药的下游因子。采用了 q-PCR荧光定量检测法检测肝癌细胞在索拉非尼及顺铂刺激下ETV4发挥耐药作用的靶基因。三、研究结果1、ETV4在肝癌组织中高表达且与肝癌患者预后不良有关。50对TCGA数据集以及1 1对新鲜肝癌组织标本均显示ETV4在肝癌中高表达,且ETV4高表达的患者无病生存率显著低于正常表达患者。2、ETV4在肝癌中与药物耐受相关。TCGA基因富集分析显示ETV4高表达组中富集的基因大多为调节阿霉素耐受的基因,且经索拉非尼及顺铂刺激后,ETV4的蛋白表达水平显著增高。上述结果提示ETV4可能参与了调节肝癌细胞对索拉非尼及顺铂耐药的生物学过程。3、ETV4促进肝癌细胞对索拉非尼及顺铂产生耐药。Western blot蛋白印迹实验显示,外源性过表达ETV4后,索拉非尼及顺铂诱导PARP与caspase3活化的能力显著下降;相反,特异性干扰ETV4表达后,索拉非尼及顺铂刺激能显著增加活性PARP及caspase3的形成。同时凋亡流式检测也显示,特异性干扰ETV4后,索拉非尼及顺铂刺激能显著增加凋亡细胞的比例。同时,EdU增殖检测发现特异性干扰ETV4的表达后,肝癌细胞的增殖能力显著下降。这表明ETV4确实参与了肝癌细胞对索拉非尼及顺铂耐药的生物学过程。4、ETV4可能通过IER3来调节肝癌细胞对索拉非尼及顺铂的耐药。为了寻找ETV4的下游作用因子,GSE96793数据集中表达上调的9个因子中有且仅有 IER3(Radiation-inducible immediate-early gene IEX-1),在肝癌细胞中特异性干扰ETV4表达后,利用q-PCR实验发现,经索拉非尼及顺铂刺激后,IER3的表达相应下调,且具有统计学意义。这提示ETV4可能通过IER3来调节肝癌细胞对索拉非尼及顺铂耐药中可能发挥了重要的作用。四、研究结论1、ETV4在肝癌中表达显著高于正常组织,且与肝癌患者无病生存率显著相关;2、ETV4调节肝癌细胞对索拉非尼及顺铂产生耐药;3、ETV4可能通过IER3来调节肝癌细胞对索拉非尼及顺铂产生耐药的功能。