论文部分内容阅读
水貂出血性肺炎是严重危害水貂养殖业健康发展的重要疫病之一。在过去很长一段时间,人们曾认为该病是由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa）感染引起的。但近十年来研究表明,P.aeruginosa单一感染对水貂的致病力并不强,不能引发水貂出血性肺炎,该病应该还有其他的诱因。H9N2亚型流感病毒（Influenza A virus,IAV）在水貂群中广泛流行,但对水貂的致病性不强,单一感染仅引起水貂轻症呼吸道疾病。但H9N2 IAV感染易于诱发P.aeruginosa继发感染,导致水貂出血性肺炎。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae）是一种在环境中广泛存在的条件致病菌,常在水貂的上呼吸道定植。为了探究H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染是否能诱发重症肺炎,开展了本研究。用本实验室分离保存的Mk/SD/F10/13（H9N2）与肺炎克雷伯菌K.pneumoniaeSD-21株,以昆明小鼠为实验动物,建立了H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染小鼠研究模型。将176只SPF级雌性昆明白小鼠（KM mice）随机分为4组,每组各44只小鼠。第1组为单一感染H9N2 IAV组（H9组）,第2组为单一感染K.pneumoniae组（KPN组）,第3组为H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染组（H9+KPN组）,第4组小鼠接种无菌PBS,作为阴性对照。接种H9N2 IAV和/或K.pneumoniae后,每天观察小鼠的临床症状,并于第3、5、7、9、11天记录小鼠体重、测量体温,采集小鼠血液制备血清以进行抗H9N2抗体检测,同时采集小鼠的脏器组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏）,称量肺脏组织的重量后计算小鼠肺指数;将一部分器官组织浸泡于10%中性福尔马林缓冲液中制作成切片以观察小鼠器官的组织病理学变化,并测定肺脏细胞凋亡指数,另一部分器官组织研磨后进行细菌载量、病毒载量以及细胞因子的检测。结果显示,H9N2 IAV单一感染小鼠未出现明显的临床症状,体重也无明显降低,这表明H9N2 IAV对小鼠的致病性较低;与H9N2 IAV或K.pneumoniae单一感染小鼠相比,H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染小鼠病程发展更快,表现严重的呼吸系统疾病,肺指数显著升高（P＜0.05）。实验小鼠肺脏病理组织学检测结果显示,H9N2IAV单一感染小鼠肺脏组织表现出中度的病理变化,K.pneumoniae单一感染小鼠肺脏内出现间质性肺炎,而H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染小鼠肺脏病理组织学损伤则比单一感染组更为严重。采用TUNEL法检测了小鼠肺细胞凋亡情况。结果表明,与H9N2 IAV/K.pneumoniae单一感染小鼠相比,H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染小鼠肺脏组织中的凋亡细胞数量显著增加,凋亡指数（AI）显著升高（P＜0.05）。将采集的小鼠脏器组织研磨后进行H9N2 IAV和K.pneumoniae的检测。将组织研磨液接种10日龄SPF鸡胚检测小鼠肺脏中H9N2 IAV的载量。结果显示,H9N2 IAV单一感染小鼠肺部H9N2 IAV载量高于H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染小鼠。K.pneumoniae单独感染小鼠各脏器细菌载量峰值均出现在5dpi,而H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染小鼠各脏器的峰值出现在7dpi,由此可知,H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染小鼠各脏器（肝脏、脾脏、肺脏、肾脏）中的K.pneumoniae清除速度相比于K.pneumoniae单一感染小鼠延迟。另外,继发性K.pneumoniae感染影响抗H9N2抗体滴度和细胞因子的水平,H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染小鼠的血清中抗H9N2抗体滴度显著高于H9N2 IAV单一感染小鼠（P＜0.05）;在病程早期,H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染小鼠肺脏匀浆中的IL-1β水平显著高于H9N2 IAV/K.pneumoniae单一感染组（P＜0.05）,病程中期阶段,H9N2 IAV继发K.pneumoniae感染小鼠肺匀浆中的IL-6水平显著高于H9N2 IAV/K.pneumoniae单一感染小鼠（P＜0.05）,各组小鼠之间检测到的TNF-α水平没有显著差异。研究结果表明,H9N2 IAV感染促进了继发感染K.pneumoniae,导致小鼠严重的呼吸系统疾病,实验动物肺脏病理损伤严重、肺脏细胞凋亡指数升高、脏器内细菌清除延迟、肺脏内细胞因子水平发生变化、死亡率升高。这些发现意味着早期预防IAV感染,对于降低动物随后发生细菌继发感染而导致的严重疾病至关重要。本研究丰富了低致病性IAV继发细菌感染的研究数据,为水貂出血性肺炎的防控提供了新的视角,同时也丰富了IAV-细菌共感染性肺炎的研究数据。