论文部分内容阅读
目的:探讨mi R-351/MLK3介导的细胞焦亡和铁死亡在慢性心力衰竭不同时期的作用以及益气温阳活血法的干预作用。方法:1.动物实验（1）动物模型建立:C57BL/6J小鼠采用主动脉缩窄（Transverse Aortic Constriction,TAC）术构建压力负荷型慢性心力衰竭模型。（2）第一部分实验研究中将动物分为（1）假手术组（简称“Sham”）,（2）模型组（简称“TAC”）,（3）模型+URMC-099组（简称“TAC+U-099”）,（4）假手术+AAVNC组(简称“Sham+AAVNC”),（5）模型+AAVNC组(简称“TAC+AAVNC”),（6）模型+AAVMLK3-组(简称“TAC+AAVMLK3-”),（7）模型+mi R351 Agomir组（简称“TAC+Agomir”）,（8）模型+mi R351 Antagomir（简称“TAC+Antagomir”）。其中,（1）—（3）组,每组75只,分为0、1、2、4、8周5个时间点,（4）—（8）组,每组30只,分为1和8周2个时间点。（3）第二部分实验研究中将动物分为（1）假手术组（简称“Sham”）,（2）模型组（简称“TAC”）,（3）假手术+URMC-099组（简称“Sham+U-099”）,（4）模型+URMC-099组（简称“TAC+U-099”）,（5）心阳片低剂量组（简称“XYT-Low-dose”）,（6）心阳片中剂量组（简称“XYT-Middle-dose”）,（7）心阳片高剂量组（简称“XYT-High-dose”）,（8）培哚普利组（简称“Perindopril”）。每组30只,分为1和8周2个时间点。2.细胞实验（1）细胞培养:培养HL1小鼠心肌细胞系,将HL1细胞培养中在含10%胎牛血清,100U/ml青霉素和/100mg/ml链霉素的MEM培养基中,培养箱环境设置为37℃、5%二氧化碳、95%空气。（2）细胞处理及干预:将LPS溶解在无菌去离子水中,以0.5?μg/ml的终浓度使用,作为焦亡作诱导剂。将MLK3抑制剂URMC-099溶解于DMSO中,使用浓度为200μM。将MCC950作为NLRP3的抑制剂,溶解于DMSO中,使用浓度为50μM。将FIN56溶解于DMSO中,终浓度0.5?μg/ml,作为铁亡诱导剂,铁亡抑制剂Ferrostatin-1溶解于DMSO中,浓度为1μM。含药血清处理时,各组细胞培养在含5%胎牛血清,5%大鼠血清培养基中。3.检测指标及方法各组小鼠或细胞完成干预后,采用小动物超声心动图观察心功能变化,采用苏木素-依红（hematoxylin-eosin,HE）染色法、Masson染色法及天狼星红染色法观察心肌纤维化及胶原蛋白沉积情况,扫描电镜观察心肌细胞焦亡情况,透射电镜观察心肌细胞线粒体形态学变化,Tunel染色法观察心肌细胞凋亡情况,冰冻切片染色观察ROS沉积情况,免疫荧光法观察心肌细胞NLRP3蛋白表达情况,免疫组化法观察心肌Collagen I、Collagen III、α-SMA、fibronectin蛋白表达情况,Western Blot法检测炎症反应、细胞焦亡、氧化损伤及铁死亡相关蛋白的表达情况,RT-PCR法检测micro RNA及炎症反应、心肌损伤和纤维化相关m RNA表达水平,比色法观察MDA、T-SOD、GSH水平变化,Caspase 1 Activity检测试剂盒检测细胞裂解液中Caspase 1 activity水平。使用Target Scan Human数据库预测与MLK3相作用的micro RNA,并采用双荧光素酶实验报告检测micro RNA和MLK3的结合作用。使用超高压液相-飞行时间高分辨质谱联用仪对心阳片主要成分进行分析。采用分子对接方法对心阳片有效成分与MLK3进行对接,预测其结合模式和亲合力,辅助判断心阳片的调控机制。结果:（1）MLK3抑制剂及中药复方心阳片能显著改善TAC小鼠不同时期的心功能,减少心肌肥大及心肌纤维化。（2）在TAC早期阶段,即1周时,与sham或Sham+AAVNC组小鼠比较,TAC组或TAC+AAVNC组小鼠,心功能显著降低,心脏显著增大,有较多炎症细胞浸润,胶原蛋白沉积显著增加（P<0.01）,细胞凋亡水平显著增高（P<0.01）,炎性小体显著增多,NF-κB p65蛋白磷酸化水平,NLRP3、ASC、AIM2、pro IL-1β、cleaved IL-1β、caspase 1、cleaved caspase 1、GSDMD和cleaved GSDMD蛋白表达水平显著增加（P<0.01或P<0.05）,心室细胞IL-1β、IL-18、MCP-1、MIP1α、ICAM1、CXCL1、CXCL2、MMP2、MMP9、collagen I和fibronectin m RNA表达水平显著增加（P<0.01）;与TAC组或TAC+AAVNC组比较,URMC-099组、TAC+AAVMLK3-组及中药低、中、高剂量组小鼠心功能明显改善,心脏大小显著减小,胶原蛋白沉积显著降低（P<0.01）,细胞凋亡水平显著降低（P<0.01）,炎性小体显著减少,NF-κB p65蛋白磷酸化水平,NLRP3、ASC、AIM2、pro IL-1β、cleaved IL-1β、caspase 1、cleaved caspase1、GSDMD、cleaved GSDMD蛋白表达水平显著降低（P<0.01或P<0.05）,心室细胞IL-1β、IL-18、MCP-1、MIP1α、ICAM1、CXCL1、CXCL2 m RNA表达水平显著降低（P<0.01）。（3）在TAC晚期阶段,即8周时,与sham或Sham+AAVNC组小鼠比较,TAC组或TAC+AAVNC组小鼠心功能显著下降,心脏显著增大,心肌细胞横截面积显著增大（P<0.01）,胶原蛋白沉积显著增加（P<0.01）,线粒体显著变小,线粒体膜密度增高,线粒体脊显著减少,并伴有线粒体外膜断裂,细胞内ROS水平显著增高（P<0.01）,MDA含量显著增加（P<0.01）,T-SOD、GSH含量显著减少（P<0.01）,心脏Collagen I、Collagen III、α-SMA、fibronectin蛋白表达水平显著升高（P<0.01）,COX2、p53、JNK蛋白表达水平显著升高（P<0.01）,FTH1、GPX4、x CT蛋白表达水平显著降低,MMP2、MMP9、collagen I和fibronectin m RNA表达水平显著增加（P<0.01）;与TAC组或TAC+AAVNC组比较,URMC-099组、TAC+AAVMLK3-组及中药低、中、高剂量组小鼠心功能明显改善,心脏大小显著减小,心肌细胞横截面积显著减小（P<0.01）,胶原蛋白沉积显著降低（P<0.01）,ROS水平显著降低（P<0.01）,MDA含量显著减少（P<0.01）,T-SOD、GSH含量显著增加（P<0.01）,心脏Collagen I、Collagen III、α-SMA、fibronectin蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,COX2、p53、JNK蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,FTH1、GPX4、x CT蛋白表达水平显著升高,MMP2、MMP9、collagen I和fibronectin m RNA表达水平显著降低（P<0.01）。（4）经LPS干预后,心肌细胞MLK3、NLRP3和GSDMD蛋白表达水平显著升高（P<0.01）,IL-18、IL-1β、ANP和BNP m RNA表达水平显著升高（P<0.01）,caspase1 activity表达水平显著升高（P<0.01）;URMC-099及心阳片含药血清干预后,MLK3、NLRP3、IL1β和GSDMD蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,IL-18、IL-1β、ANP和BNP m RNA表达水平（P<0.01）,caspase 1 activity表达水平显著降低（P<0.01）;MCC950干预后NLRP3和GSDMD蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,IL-18、IL-1β、ANP和BNP m RNA表达水平显著降低（P<0.01）,caspase 1 activity表达水平显著降低（P<0.01）。（5）经FIN56干预后,MLK3、p-JNK、p53和COX2蛋白表达水平显著升高（P<0.01）,FTH1蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,MDA表达水平显著升高（P<0.01）,T-SOD和GSH表达水平显著降低（P<0.01）,ANP和BNP m RNA表达水平显著升高（P<0.01）;URMC-099及心阳片含药血清干预后,MLK3、p-JNK、p53和COX2蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,GPX4和FTH1表达水平显著升高（P<0.01）,MDA表达水平显著降低（P<0.01）,T-SOD和GSH表达水平显著升高（P<0.01）,ANP和BNP m RNA表达水平显著降低（P<0.01）;Ferrostatin-1干预后,COX2蛋白表达水平显著降低（P<0.01）,FTH1表达水平显著升高（P<0.01）,MDA表达水平显著降低（P<0.01）,T-SOD和GSH表达水平显著升高（P<0.01）,ANP和BNP m RNA表达水平显著降低（P<0.01）。（6）与Sham组小鼠比较,TAC组小鼠心脏mi R351在0、1、2、4、8周均显著降低,当提高mi R351水平后,MLK3 m RNA表达显著降低（P<0.01）,心功能、心肌肥大及胶原蛋白沉积情况得到显著改善,双荧光素酶报告结果显示,野生型MLK3载体共转染了mi R351 mimics后与对照组相比荧光素酶表达水平显著降低（P<0.01）,而突变型MLK3载体共转染了mi R351 mimics后与对照组相比荧光素酶表达水平无显著差异（P>0.05）。中药低、中、高剂量组在第1周和第8周时能够显著提高mi R351表达水平（P<0.01）。（7）超高压液相-飞行时间高分辨质谱联用仪对心阳片主要成分进行分析结果显示,心阳片提取物正负离子模式下共检测到52种中药活性成分,其中与MLK3有有效亲和力,结合能小于-6.0 kcal/mol的有24个。结论:miR-351/MLK3在慢性心力衰竭心室重塑过程中发挥重要作用,早期主要以调控NF-κB/NLRP3介导的炎症反应和细胞焦亡为主,而晚期则主要以调控p53/JNK/x CT介导的氧化损伤和铁死亡为主,益气温阳活血利水中药复方心阳片能够有效改善慢性心力衰竭心室重塑,其作用机制可能是通过调控mi R-351/MLK3介导的炎症反应和细胞焦亡以及氧化损伤和铁死亡。