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苦瓜具有一定的食疗和药理功效,苦瓜多糖和苦瓜皂苷类物质更是具有一定的功能作用,他们具有一定的降血糖,增加抵抗力,抗病毒以及抗癌等功效。而乳腺癌在女性人群中最为常见,是及其难以治愈的疾病,也是导致死亡的原因之一。采用苦瓜多糖和皂苷对乳腺癌细胞MCF-7进行作用,可以有效地降低乳腺癌细胞MCF-7的增值,尤其是苦瓜皂苷作用更佳。 本论文以苦瓜多糖和皂苷为研究对象,通过大孔吸附树脂对苦瓜多糖纯化进行响应面优化试验,研究洗脱剂浓度、上样体积和洗脱剂用量对苦瓜多糖纯化效果的影响,并确定了优化的最佳工艺参数;采用泡沫分离技术对苦瓜皂苷进行进一步的纯化,研究不同物质量浓度、PH和温度对纯化效果的影响,通过正交试验确定最佳的纯化工艺条件;采用MTT法研究苦瓜多糖和苦瓜皂苷对乳腺癌细胞的增值抑制效果,并进一步应用HE染色、流式细胞技术和western-blot方法,对苦瓜皂苷抑制乳腺癌细胞增值机理进行了进一步的探讨。通过以上实验得出以下结论: (1)通过对苦瓜多糖的纯化研究可知:在室温条件下多糖上样的质量浓度为2.0mg/mL,多糖上样体积为3BV,洗脱剂浓度为50%,洗脱剂体积为2BV时,纯化效果最好,多糖含量从26.01%提高到66.5%。纯化前后苦瓜多糖中蛋白质含量分别为4.12%和5.60%,水分含量分别为19.2%和18.9%。纯化后苦瓜蛋白含量反而增加,水分含量基本保持不变。 (2)通过对苦瓜皂苷的纯化研究可知:在物质量浓度为1.6mg/ml、PH为7.5和温度为30℃时,对苦瓜皂苷的纯化效果最好,纯度为92.8%;定性实验验证所提取的物质为皂苷类物质;经HPLC图谱分析,确定所提的苦瓜皂苷成分与张玉婵等提取的皂苷成分一致。说明苦瓜皂苷提取纯化技术的稳定性。 (3)MCF-7增殖抑制试验结果表明:糖纯度为26.01%,多糖作用浓度200μg/ml时,对MCF-7的抑制率达到最大值,为49.5%;多糖纯度为66.5%,多糖作用浓度仅为6.25μg/ml,对MCF-7的抑制率可达到最大值,为46.5%。纯化后的苦瓜多糖用量比纯化前的用量显著降低。这与苦瓜多糖的纯度有直接的关系;苦瓜皂苷对乳腺癌细胞的作用呈现时间和剂量依赖性,经24h和48h作用后,抑制率随剂量的增加而增大,且当苦瓜皂苷作用浓度达到500μg/ml时,两个不同作用时间段的抑制率相差不大,最佳抑制率为86%。 (4)HE试验结果表明,皂苷作用后的细胞呈现明显的胞浆浓缩、细胞质连接不紧密,细胞变小,核破碎,并有凋亡小体出现;经流式细胞术可检测到细胞周期的变化,经皂苷作用后,细胞凋亡率增加,细胞S期数目也显著增加,G1、G2期数目有所下降,且G2期数目下降更显著,这说明皂苷将细胞主要阻遏在S期。 (5)Western-blot试验进一步对皂苷的作用机理进行了研究,经研究随着苦瓜皂苷浓度的增加抗凋亡蛋白bcl-2的表达越少,所以皂苷是通过抑制抗凋亡蛋白bcl-2的表达来增加乳腺癌细胞MCF-7的凋亡的。