论文部分内容阅读
植物的次生生长是一项重要的生命活动,其中植物次生木质部的形成对人类生产和生活尤其具有重大意义。NAC转录因子是近年来新发现的植物特有的转录调控因子,在植物的生长发育、逆境胁迫以及作物的品质改良中起着重要作用。研究发现拟南芥中的NAC转录因子SND1是纤维细胞次生壁加厚的关键性调控因子,同时毛果杨中的NAC转录因子PtrWNDs可能启动整个次生壁的生物合成,其中WNDD1B基因与拟南芥SND1基因高度同源。在本文中,我们对WND1B的启动子进行了克隆与缺失分析,主要研究结果如下：(1) PtrWND1B基因启动子的克隆。根据PtrWND1B的基因组序列进行BLAST分析,取起始密码子上游2146bp的5’调控序列,设计引物进行克隆。将克隆产物连接至pMD19-T载体,转化大肠杆菌Top10菌株,进行测序验证。通过测序结果比对,确认获得了正确序列,将其命名为PtrWND1BP。序列分析表明,该序列含典型的真核生物核心启动子区域、一些与激素、胁迫诱导相关的顺式作用元件和其他重要元件。(2)PtrWND1B基因启动子缺失序列的克隆。根据PtrWND1BP序列设计引物,通过PCR技术获得了4个缺失片段。将产物克隆至pMD19-T载体,转化大肠杆菌Top10菌株,进行测序验证。通过测序结果比对,确认获得了正确序列,将其分别命名为PtrWND1BP-F2、PtrWND1BP-F3、PtrWND1BP-F4和PtrWND1BP-F5。(3)PtrWND1B基因启动子及其缺失序列的瞬时表达。设计特异引物,构建GUS基因表达载体pCAMBIA1301POG-1BP/1BP-F2/1BP-F3/1BP-F4/1BP-F5-GUS.以烟草为试材进行瞬时表达,检测表达活性。结果显示PtrWND1B基因启动子及其缺失序列PtrWND1BP-F3、PtrWND1BP-F4和PtrWND1BP-F5可激活GUS基因表达。(4)PtrWND1B基因启动子及其缺失序列遗传转化拟南芥。采用花粉管通道法将表达载体pCAMBIA1301POG-1BP/1BP-F2/1BP-F3/1BP-F4/1BP-F5一GUS转入拟南芥植株,进行GUS组织化学染色分析。结果发现PtrWND1B基因启动子激活基因在植株维管束中表达,同时证明了PtrWND1B基因启动子及其各缺失序列均可激活GUS基因表达,找到了PtrWND1BP中具有启动子活性的最短序列。(5)PtrWND1B基因启动子及其缺失序列的酶活测定。将表达载体pCAMBIA1301POG-1BP/1BP-F2/1BP-F3/1BP-F4/1BP-F5-GUS转入烟草叶片。提取叶片中的GUS蛋白进行酶活测定,比较PtrWND1BP.PtrWND1BP-F2.PtrWND1BP-F3与对照组的活性。结果显示PtrWND1BP和其最短缺失序列PtrWND1BP-F3具有启动基因转录的活性,同时PtrWND1BP-F2所缺失序列对启动子活性具有重要影响。