背景及目的：　　 转化生长因子beta 1（TGF-β1）信号通过Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受体（TGF-ΒrⅠ和TGF-ΒrⅡ）途径，可抑制肿瘤细胞生长。在肿瘤发生发展过程中，肿瘤细胞常常通过TGF-β受体的下调或者突变，逃避TGF-β信号对其生长抑制作用。但是，TGF-β1 激活的信号还能促进肿瘤细胞迁徙，具有促肿瘤的作用，这就是著名的TGF-β“双向”作用。恶性肿瘤细胞如何逃避TGF-β信号的生长阻滞作用，并促进肿瘤转移能力，其机制仍不完全清楚。本研究旨在探讨TGF-ΒrⅡ的表达和分子状态在膀胱癌肿瘤中的作用及其机制，以及与临床关系及其意义，为以其为靶点的肿瘤干预策略提供实验依据。　　 方法:　　 1.TGF-β1 及其TGF-β受体在多种肿瘤细胞系中的表达检测　　 1）应用Real-time PCR检测各种肿瘤细胞系（乳腺癌，肝癌，肺癌，胃癌，子宫颈癌，白血病，前列腺癌，黑色素瘤及膀胱癌细胞）中TGF-ΒrⅠ，TGF-ΒrⅡ，TGF-β1的表达。　　 2）应用流式细胞术（FCM）检测L02，MCF-7，A549，T24，ScaBER和BIU-87细胞表面TGF-ΒrⅡ的表达，胞浆中TGF-β1的表达。　　 3）应用细胞免疫组化法（细胞爬片）检测L02，MCF-7，A549，T24，ScaBER和BIU-87细胞表面的TGF-ΒrⅡ的染色程度。　　 2.L02，ScaBER和T24细胞中TGF-β信号的阻断试验　　 1）将本室构建的可溶性II 型TGF-β受体（Fc:TβRII；与TGF-ΒrⅡ竞争结合TGF-β1，阻断TGF-β信号通路）转染至实验细胞中，应用Western blot 方法检测细胞上清中Fc:TβRII的表达。　　 2）将Smad2/3的siRNA 转染肿瘤细胞，应用抗Smad2/3 抗体，Western blot的方法检测细胞中Smad2/3的表达。　　 3.TGF-ΒrⅡ对肿瘤细胞生长、细胞活力影响的实验　　 1）用PKH-26 将目的细胞染色后，应用流式细胞术检测48 h后各组细胞的增殖水平（用刺激指数表示）。　　 2）应用Transwell 实验检测肿瘤细胞的侵袭和转移情况，用苏木素-伊红染色后随机选取五个视野计数分组：①对照组；②Fc:TβRII 转染组；③TGF-β1 刺激组；④Si-Smad2/3组。　　 4.膀胱癌细胞及组织标本中TGF-ΒrⅡ序列测定，及其突变分析　　 首先，针对TGF-ΒrⅡ编码区第383-2086bp 设计TGF-ΒrⅡ的测序引物；应用RT-PCR方法进行TGF-ΒrⅡ基因扩增；然后，利用琼脂糖凝胶电泳显示目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行产物回收，纯化；送至上海英骏公司进行序列测定；利用pubmed中BLAST 将测序结果与TGF-ΒrⅡ基因序列进行比对分析。　　 5.检测膀胱癌细胞中TGF-β1/TGF-ΒrⅡ信号激活的下游通路　　 1）应用Western blot 检测TGFβ经典信号通路中的Smad 磷酸化形式pSmad 蛋白的表达。　　 2）应用IP（免疫共沉淀）检测TGF-ΒrⅡ复合体与Smad的结合。　　 3）在TGFβ1（2 ng/ml）刺激0 h，2 h和4 h 不同时间段，应用Real-time PCR检测L02，ScaBER和T24细胞中增殖相关基因p15，细胞分裂周期蛋白Cdc25A及促迁移活性的转录因子CUTL1的表达。　　 4）在TGFβ1（2 ng/ml）刺激0 h，4 h和8 h 不同时间段，应用Western blot 检测实验细胞中增殖及侵袭转移相关基因的表达。　　 6.从膀胱癌标本中分离原代细胞后，检测TGFβ信号对TGF-ΒrⅡ突变群（a）与未突变群（b）生物学特性的影响　　 1）从膀胱癌组织标本中分离原代膀胱癌细胞。　　 2）应用免疫组化试验检测a组和b组细胞表面TGF-ΒrⅡ的表达。　　 3）利用FCM 检测膀胱癌原代细胞的增殖能力（SI）分组：①0 h 对照组；②24 h 对照组；③24 h 刺激组（TGF-β1）。　　 4）利用Transwell 侵袭转移试验检测膀胱癌原代细胞的活力和迁移能力；分组：①对照组；②TGF-β1 刺激组；③Fc:TβRII 转染组。　　 5）利用RT-PCR检测TGF-β1 刺激0 h，2 h和4 h后，a,b 两组中p15，Cdc25A和CUTL1的表达。　　 结果:　　 1.TGF-β1在大多数肿瘤细胞中过表达，而TGF-ΒrⅠ和TGF-ΒrⅡ在多种人类肿瘤细胞表面低表达，仅仅在人类膀胱癌细胞株T24表面，TGF-ΒrⅡ高表达，通过序列分析，在跨膜区的116 位，118 位，以及胞浆段269 位发生点突变；269 位的Ser/Thr 激酶域的G→A（Glu269 → Lys）点突变，致使蛋白质变性，由酸性氨基酸转换为碱性氨基酸。　　 2.在TGF-β1 刺激下，IP 试验证明上述突变不影响TGF-ΒrⅡ与Smad2/3的结合，而且增殖试验结果表明TGF-ΒrⅡ的突变，反而解除了TGF-β1 信号对肿瘤生长的抑制作用；Transwell 试验说明发生点突变的TGF-ΒrⅡ/TGF-β信号能促强肿瘤细胞的运动和迁移能力。　　 3.进一步运用RT-PCR和Western blot 试验，对下游细胞增殖相关基因p15和Cdc25A 及动力相关基因CUTL1的检测发现，TGF-ΒrⅡ突变体介导的信号途径能下调p15的表达，上调Cdc25A的表达，同时提高CUTL的表达，不抑制肿瘤的生长，而且促进了肿瘤细胞的侵袭转移能力。　　 4.膀胱癌细胞系以及原代膀胱癌细胞中，转染重组质粒Fc:TβRII或Smad2/3的siRNA，TGF-β信号被阻断；发生TGF-ΒrⅡ突变的癌细胞群中，p15和Cdc25A的表达无明显变化，但CUTL1的表达明显上调；　　 5.在膀胱癌标本中，TGF-ΒrⅡ基因发生的G→A 点突变（与膀胱癌细胞系T24中的TGF-ΒrⅡ突变类型一致）比例高达39.1％，与膀胱癌临床分期中的T2级（P=0.007，＜0.01）以及病理分级的高级别瘤（P=0.003，＜0.01）密切相关。　　 结论:本实验研究首次发现TGF-ΒrⅡ在膀胱癌细胞系中的点突变，与膀胱移行上皮癌T24的侵袭转移密切相关，并在高转移，高侵袭的膀胱癌病人的肿瘤标本中发现同样的突变类型，说明TGF-ΒrⅡ的点突变很可能为膀胱癌转移的重要标志，这为TGF-β1 信号在肿瘤发生中的所发挥的调节作用提供了证据，并且为进一步的机制研究提供了可靠的线索，对于目前以TGF-β1 为靶点的肿瘤治疗，特别是膀胱癌病人的治疗，提供了新的依据和信息。