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背景及目的:
转化生长因子beta 1(TGF-β1)信号通过Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受体(TGF-ΒrⅠ和TGF-ΒrⅡ)途径,可抑制肿瘤细胞生长。在肿瘤发生发展过程中,肿瘤细胞常常通过TGF-β受体的下调或者突变,逃避TGF-β信号对其生长抑制作用。但是,TGF-β1 激活的信号还能促进肿瘤细胞迁徙,具有促肿瘤的作用,这就是著名的TGF-β“双向”作用。恶性肿瘤细胞如何逃避TGF-β信号的生长阻滞作用,并促进肿瘤转移能力,其机制仍不完全清楚。本研究旨在探讨TGF-ΒrⅡ的表达和分子状态在膀胱癌肿瘤中的作用及其机制,以及与临床关系及其意义,为以其为靶点的肿瘤干预策略提供实验依据。
方法:
1.TGF-β1 及其TGF-β受体在多种肿瘤细胞系中的表达检测
1)应用Real-time PCR检测各种肿瘤细胞系(乳腺癌,肝癌,肺癌,胃癌,子宫颈癌,白血病,前列腺癌,黑色素瘤及膀胱癌细胞)中TGF-ΒrⅠ,TGF-ΒrⅡ,TGF-β1的表达。
2)应用流式细胞术(FCM)检测L02,MCF-7,A549,T24,ScaBER和BIU-87细胞表面TGF-ΒrⅡ的表达,胞浆中TGF-β1的表达。
3)应用细胞免疫组化法(细胞爬片)检测L02,MCF-7,A549,T24,ScaBER和BIU-87细胞表面的TGF-ΒrⅡ的染色程度。
2.L02,ScaBER和T24细胞中TGF-β信号的阻断试验
1)将本室构建的可溶性II 型TGF-β受体(Fc:TβRII;与TGF-ΒrⅡ竞争结合TGF-β1,阻断TGF-β信号通路)转染至实验细胞中,应用Western blot 方法检测细胞上清中Fc:TβRII的表达。
2)将Smad2/3的siRNA 转染肿瘤细胞,应用抗Smad2/3 抗体,Western blot的方法检测细胞中Smad2/3的表达。
3.TGF-ΒrⅡ对肿瘤细胞生长、细胞活力影响的实验
1)用PKH-26 将目的细胞染色后,应用流式细胞术检测48 h后各组细胞的增殖水平(用刺激指数表示)。
2)应用Transwell 实验检测肿瘤细胞的侵袭和转移情况,用苏木素-伊红染色后随机选取五个视野计数分组:①对照组;②Fc:TβRII 转染组;③TGF-β1 刺激组;④Si-Smad2/3组。
4.膀胱癌细胞及组织标本中TGF-ΒrⅡ序列测定,及其突变分析
首先,针对TGF-ΒrⅡ编码区第383-2086bp 设计TGF-ΒrⅡ的测序引物;应用RT-PCR方法进行TGF-ΒrⅡ基因扩增;然后,利用琼脂糖凝胶电泳显示目的条带,用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行产物回收,纯化;送至上海英骏公司进行序列测定;利用pubmed中BLAST 将测序结果与TGF-ΒrⅡ基因序列进行比对分析。
5.检测膀胱癌细胞中TGF-β1/TGF-ΒrⅡ信号激活的下游通路
1)应用Western blot 检测TGFβ经典信号通路中的Smad 磷酸化形式pSmad 蛋白的表达。
2)应用IP(免疫共沉淀)检测TGF-ΒrⅡ复合体与Smad的结合。
3)在TGFβ1(2 ng/ml)刺激0 h,2 h和4 h 不同时间段,应用Real-time PCR检测L02,ScaBER和T24细胞中增殖相关基因p15,细胞分裂周期蛋白Cdc25A及促迁移活性的转录因子CUTL1的表达。
4)在TGFβ1(2 ng/ml)刺激0 h,4 h和8 h 不同时间段,应用Western blot 检测实验细胞中增殖及侵袭转移相关基因的表达。
6.从膀胱癌标本中分离原代细胞后,检测TGFβ信号对TGF-ΒrⅡ突变群(a)与未突变群(b)生物学特性的影响
1)从膀胱癌组织标本中分离原代膀胱癌细胞。
2)应用免疫组化试验检测a组和b组细胞表面TGF-ΒrⅡ的表达。
3)利用FCM 检测膀胱癌原代细胞的增殖能力(SI)分组:①0 h 对照组;②24 h 对照组;③24 h 刺激组(TGF-β1)。
4)利用Transwell 侵袭转移试验检测膀胱癌原代细胞的活力和迁移能力;分组:①对照组;②TGF-β1 刺激组;③Fc:TβRII 转染组。
5)利用RT-PCR检测TGF-β1 刺激0 h,2 h和4 h后,a,b 两组中p15,Cdc25A和CUTL1的表达。
结果:
1.TGF-β1在大多数肿瘤细胞中过表达,而TGF-ΒrⅠ和TGF-ΒrⅡ在多种人类肿瘤细胞表面低表达,仅仅在人类膀胱癌细胞株T24表面,TGF-ΒrⅡ高表达,通过序列分析,在跨膜区的116 位,118 位,以及胞浆段269 位发生点突变;269 位的Ser/Thr 激酶域的G→A(Glu269 → Lys)点突变,致使蛋白质变性,由酸性氨基酸转换为碱性氨基酸。
2.在TGF-β1 刺激下,IP 试验证明上述突变不影响TGF-ΒrⅡ与Smad2/3的结合,而且增殖试验结果表明TGF-ΒrⅡ的突变,反而解除了TGF-β1 信号对肿瘤生长的抑制作用;Transwell 试验说明发生点突变的TGF-ΒrⅡ/TGF-β信号能促强肿瘤细胞的运动和迁移能力。
3.进一步运用RT-PCR和Western blot 试验,对下游细胞增殖相关基因p15和Cdc25A 及动力相关基因CUTL1的检测发现,TGF-ΒrⅡ突变体介导的信号途径能下调p15的表达,上调Cdc25A的表达,同时提高CUTL的表达,不抑制肿瘤的生长,而且促进了肿瘤细胞的侵袭转移能力。
4.膀胱癌细胞系以及原代膀胱癌细胞中,转染重组质粒Fc:TβRII或Smad2/3的siRNA,TGF-β信号被阻断;发生TGF-ΒrⅡ突变的癌细胞群中,p15和Cdc25A的表达无明显变化,但CUTL1的表达明显上调;
5.在膀胱癌标本中,TGF-ΒrⅡ基因发生的G→A 点突变(与膀胱癌细胞系T24中的TGF-ΒrⅡ突变类型一致)比例高达39.1%,与膀胱癌临床分期中的T2级(P=0.007,<0.01)以及病理分级的高级别瘤(P=0.003,<0.01)密切相关。
结论:本实验研究首次发现TGF-ΒrⅡ在膀胱癌细胞系中的点突变,与膀胱移行上皮癌T24的侵袭转移密切相关,并在高转移,高侵袭的膀胱癌病人的肿瘤标本中发现同样的突变类型,说明TGF-ΒrⅡ的点突变很可能为膀胱癌转移的重要标志,这为TGF-β1 信号在肿瘤发生中的所发挥的调节作用提供了证据,并且为进一步的机制研究提供了可靠的线索,对于目前以TGF-β1 为靶点的肿瘤治疗,特别是膀胱癌病人的治疗,提供了新的依据和信息。