【摘 要】
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目的:以HAAM为支架材料负载种子细胞h AMSCs构建组织工程“仿生羊膜”,并在体外研究其存活、增殖和分泌功能。方法:（1）人脱细胞羊膜（Human acellular amniotic membrane,HAAM）支架的制备及选择:获得的人新鲜羊膜分别做以下处理,A组:不做任何处理（对照组）;B组:1%Triton X-100+0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na溶液（Triton+
【基金项目】
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国家自然科学基金（81660293）; 遵义市科技局市院联合基金项目 [遵市科合 H2 字（2020）281 号]
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目的:以HAAM为支架材料负载种子细胞h AMSCs构建组织工程“仿生羊膜”,并在体外研究其存活、增殖和分泌功能。方法:（1）人脱细胞羊膜（Human acellular amniotic membrane,HAAM）支架的制备及选择:获得的人新鲜羊膜分别做以下处理,A组:不做任何处理（对照组）;B组:1%Triton X-100+0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na溶液（Triton+胰酶法）;C组:3m M Na Cl溶液+0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na溶液（高渗+胰酶法）;D组:0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na溶液+物理刮擦法（胰酶+刮擦法）。对比不同方法制备HAAM支架,采用HE染色、扫描电镜、厚度和力学性能检测其脱细胞程度、剩余细胞外基质组成、基底膜完整性和生物力学性能,从而选择出具有良好生物相容性和力学性能的HAAM支架。（2）人羊膜间充质干细胞（Human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs）的分离及鉴定:采用胰酶和胶原酶分离提取h AMSCs,用差速贴壁法传代纯化,通过倒置相差显微镜观察细胞形态后传代至P3代,通过细胞形态学、流式细胞术免疫表型对h AMSCs进行鉴定,用于后续与HAAM支架复合培养实验。（3）“仿生羊膜”的制备及其特性检测:实验分为2组:二维无支架组（对照组）、三维支架组（实验组）;将h AMSCs分别种植在普通细胞培养板上和HAAM支架上,倒置相差显微镜和扫描电镜观察1、3、7d细胞生长及增殖情况;Live/Dead检测h AMSCs在两组中的存活情况;CCK-8检测h AMSCs两组中生长增殖情况;采用ELISA分析h AMSCs在两组中细胞因子的含量。结果:（1）采用Triton+胰酶法制备HAAM支架相较于高渗+胰酶法、胰酶+刮擦法更优,经HE染色和扫描电镜观察发现Triton+胰酶法制备的HAAM支架上皮层以及基质中细胞成分全部被移除,基底膜层连续完整,胶原成分仍然存在,且在厚度和力学性能方面与人新鲜羊膜相比无明显减弱。（2）采用两步酶消法获得的P3代h AMSCs细胞呈贴壁、长梭形、漩涡状生长,高表达CD44、CD73、CD90、CD105,低表达CD34、CD19、CD45、CD11b和HLADR。（3）倒置相差显微镜和扫描电镜观察HAAM支架上h AMSCs存活良好,细胞生长于三维空间网内且随着培养时间延长支架上细胞逐渐增多;Live/Dead和CCK-8结果显示三维支架组（实验组）中细胞存活率和增殖活性相较于二维无支架组（对照组）均升高。三维支架组（实验组）h AMSCs分泌因子VEGF、b FGF和Collagen I表达量高于二维无支架组（对照组）（P＜0.05）,而TGF-β1、α-SMA表达较二维无支架组（对照组）下降（P＜0.05）。结论:（1）采用Triton+胰酶法制备的HAAM支架无细胞残留且具有良好的细胞相容性和生物力学性能,是理想的支架材料。（2）采用酶消法成功分离获得h AMSCs。（3）成功构建“仿生羊膜”且HAAM支架具有良好细胞相容性,在体外能够模拟细胞外基质成分,促进h AMSCs黏附、增殖以及子宫内膜修复相关因子的分泌。
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