论文部分内容阅读
目的:1.体外分离人子宫内膜间充质干细胞（human endometrial mesenchymal stem cell,hEMSCs）,探讨其是否具有MSCs特性。2.研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）与转化生长因子-β1（Transforming growth factors-β1,TGF-β1）对体外培养hEMSCs向韧带成纤维细胞分化作用影响。方法:1.hEMSCs的体外分离、鉴定:采用酶消法结合反复贴壁法分离纯化获得的hEMSCs。倒置显微镜下观察细胞形态。流式细胞仪检测细胞表面特异抗原阳性率。采用特定的诱导培养基体外诱导hEMSCs向成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞的分化,并分别使油红0染色、茜素红染色及阿利新蓝染色法检测hEMSCs向成脂、成骨及成软骨细胞分化效果。MTS检测细胞增殖活性并绘制细胞的生长曲线。2.使用第四代hEMSCs,按照在培养基中分别添加bFGF、TGF-β1以及bFGF+TGF-β1联合处理为实验组,加入正常培养基为对照组。培养3天后倒置相差显微镜下观察各组细胞形态变化情况;培养12、24、36、48、60h MTS检测各组细胞增殖活性情况;培养3天后采用实时荧光定量PCR检测各组细胞Ⅰ型胶原mRNA表达情况及免疫荧光检测各组细胞Ⅰ型胶原蛋白表达情况。3.应用graphpad prism 7软件包进行数据处理。所有数据结果均采用平均数±标准差（?±）表示。两组间差异比较采用t检验,以α=0.05作为检验水准,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.采用酶消法结合反复贴壁法可体外分离纯化hEMSCs。倒置显微镜下观察hEMSCs经多次传代后其细胞形态均一,呈成纤维样,呈旋涡状或平行排列生长。流式细胞仪检测第四代hEMSCs表面特异抗原表现出CD73、CD90、CD105阳性,分别为99.9%、97.3%、99.7%;CD34、CD45、CD11b、CD19及HLA-DR阴性,为1.7%。油红O染色显示:成脂诱导后,细胞浆内可见脂滴;茜素红染色显示:成骨诱导后细胞外存在多个矿化结节;阿利新蓝染色显示:成软骨诱导后,大量的糖胺聚糖被分泌到细胞基质中。细胞生长曲线显示细胞增殖能力强。以上结果证实获得的细胞符合间充质干细胞的特征。2.分别经bFGF、TGF-β1及bFGF+TGF-β1联合干预后:（1）培养3天后倒置相差显微镜下观察示细胞形态结果显示:与对照组比较,bFGF组、bFGF+TGF-β1组细胞形态更加细长,呈“树突”状,更趋向于成纤维细胞特性,而TGF-β1组细胞形态增宽,呈扩散趋势。（2）MTS检测培养12、24、36、48、60h各组细胞细胞增殖速率结果显示:bFGF组、TGF-β1组、bFGF+TGF-β1组细胞增殖速率较对照组均明显增快,差异具有统计学意义（P<0.05）;与bFGF组、TGF-β1组相比较,bFGF+TGF-β1组细胞增殖速率增快更加明显,差异具有统计学意义（P<0.05）;提示bFGF与TGF-β1均可以促进细胞增殖,且两者联合后促进细胞增殖作用更加显著。（3）培养3天后实时荧光定量PCR结果显示:与对照组比较,bFGF组Ⅰ型胶原mRNA表达明显下调,TGF-β1组及bFGF+TGF-β1组Ⅰ型胶原mRNA表达均上调,差异均具有统计学意义（P<0.05）,但bFGF+TGF-β1组Ⅰ型胶原mRNA表达上调趋势小,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）免疫荧光染色结果显示:I型胶原蛋白主要分布在细胞质内。与对照组比较,bFGF组Ⅰ型胶原蛋白表达明显降低,TGF-β1组及bFGF+TGF-β1组Ⅰ型胶原蛋白表达均有所增加,但bFGF+TGF-β1组Ⅰ型胶原蛋白表达增加程度小。结论:1.hEMSCs具有MSCs特征,可作为韧带组织工程种子细胞来源。2.bFGF可促使hEMSCs细胞形态更趋向成纤维细胞特性。bFGF与TGF-β1联合促进hEMSCs增殖的效果更加明显。bFGF、TGF-β1对I型胶原合成具有一定的拮抗作用,bFGF具有抑制I型胶原合成的效应,而TGF-β1则具有促进I型胶原合成的效应,bFGF与TGF-β1联合使I型胶原的合成和降解的处于动态平衡的状态,总体增加了I型胶原的表达量,对hEMSCs向韧带成纤维细胞分化具有促进作用。