经皮腔内冠状动脉血管成形术( PTCA )作为心血管治疗学上的里程碑性突破,成功率超过了95%。但是再狭窄的发生严重限制了它的远期疗效。现有的理论认为,再狭窄是血管对创伤性治疗的一种与伤口愈合过程相同的病理性修复反应,是一个非感染性炎症反应过程。其始动因素包括球囊扩张对血管壁的直接损伤、血管壁的弹性回缩、血小板的粘附聚集等,继而导致生长因子等多种生物活性物质的释放,后者引起损伤局部血管重建和再塑过程。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的异常迁移、增殖、凋亡及细胞外基质分泌和堆积与一系列基因异常表达有关。因此,寻找可抑制VSMC异常增殖、阻断或减缓再狭窄病变的有效药物,已成为当前研发抗心血管疾病药物的重要目标之一。欧亚旋覆花是一种传统中药,具有活血化瘀、抗炎镇痛之功效。用氯仿抽提法从旋覆花中分离得到的有效部位——旋覆花素中含有抗炎单体旋覆花内酯(ABL)。基于血管再狭窄是一种慢性炎症性疾病,本研究通过观察旋覆花素对内皮剥脱诱导的新生内膜形成的干预效应,探讨其作用机制,旨在确定该有效部位的药用价值和作用途径。1旋覆花素通过抑制炎症和增殖相关基因的表达而减缓血管新生内膜的形成目前认为,造成血管成形术后再狭窄的核心问题是血管平滑肌细胞的异常增殖与迁移。核转录因子κB(NF-κB)是一种多向性转录因子,它的结合序列存在于多种促炎和促增殖基因的调控区中,通过激活靶基因表达,广泛地参与机体的免疫炎症反应、细胞周期调控、细胞增殖分化与凋亡等过程,在平滑肌细胞的异常增殖过程中起着关键性的调节作用。为了确定旋覆花素是否可抑制内皮剥脱后新生内膜的形成,本实验用主动脉球囊损伤的大鼠模型,采用免疫组织化学及Western blot方法,观察旋覆花素的抗炎抗增殖效应。实验结果如下:1.1旋覆花素对血管内皮损伤诱导的内膜增厚的影响形态学分析可见,球囊损伤21天后,血管内膜向管腔内凸起,VSMC大量增生且排列紊乱,内膜呈弥散性增厚;管腔缩小;I/M比值明显增加达1.76±0.11。旋覆花素给药组的内膜增厚程度比模型组显著减轻,I/M比值降低至0.76±0.16,与模型组相比具有显著性差异(P<0.05)。1.2旋覆花素抑制内皮剥脱诱导的NF-κB p65核转位为了探讨NF-κB在旋覆花素抑制内皮剥脱诱导的血管炎性增生中的作用,本实验检测了NF-κB p65在损伤血管中的表达变化与定位。结果发现,模型组新生内膜处可见大量p65阳性染色细胞;给旋覆花素治疗组,p65阳性染色细胞显著减少。Western blot分析发现,在对照组细胞核中仅有少量的p65存在;而模型组核内p65水平明显升高;服用旋覆花素的给药组核p65的表达量下降明显。但三组血管细胞浆中p65的含量无明显差异。可见,旋覆花素具有抑制内皮剥脱诱导的p65表达与核转位的效应。1.3旋覆花素抑制内皮剥脱诱导的IκB降解IκB是NF-κB的抑制性蛋白,通常情况下与NF-κB结合,使其以失活状态存在于细胞浆中。一旦IκB发生磷酸化降解,就可以暴露出NF-κB的核定位序列,进而转位入核,启动相关基因的表达。为了探讨IκB在旋覆花素抑制内皮剥脱诱导的血管炎性增生中的作用,本实验检测了IκB在损伤血管中的表达变化。免疫组化染色结果发现,IκB阳性染色细胞在对照组主动脉中仅有少量的表达,在模型组明显减少,而给旋覆花素治疗组中可见大量表达。IκB阳性细胞数及着色强度与球囊剥脱后新生内膜的增厚程度之间存在一定的负相关关系。Western blot分析可见,模型组IκB蛋白表达显著减少,而给旋覆花素治疗组IκB表达明显增多。可见,旋覆花素可以通过阻止新生内皮剥脱诱导的IκB降解,进而抑制NF-κB的激活,最终发挥抑制新生内膜增生的作用。1.4旋覆花素抑制新生内膜中C-Jun、PCNA的表达C-Jun和PCNA是反映细胞增殖的重要生物学指标。为探讨旋覆花素的抗增殖作用,本实验检测了C-Jun、PCNA在损伤血管中的表达变化。Western blot分析发现,模型组AP-1、PCNA的表达明显增多,给旋覆花素治疗组两者的表达下降。免疫组化染色也得到相似结果。提示内膜增生程度与AP-1、PCNA的表达量之间存在着一定的关系,旋覆花素抑制AP-1、PCNA的表达可能是其抗内膜增生的途径之一。1.5旋覆花素抑制内皮剥脱诱导的COX-2的表达COX-2是组织细胞炎症反应的重要标志之一。为了观察旋覆花素的抗炎效应,本实验检测了其对COX-2表达的影响。Western blot结果显示,对照组血管壁仅有少量的COX-2表达;模型组的新生内膜中COX-2的表达显著升高;旋覆花素治疗组COX-2的表达量下降明显。提示旋覆花素抑制内膜增生的作用与其抗炎功能之间存在着一定的相关性。2旋覆花素抑制血管内皮剥脱诱导的粘附与迁移相关基因的表达由于细胞粘附与迁移是损伤诱导的血管新生内膜形成的生物学基础,为了探讨旋覆花素是否干预该过程,本研究观察了给予旋覆花素处理后,内皮剥脱局部血管壁粘附分子及细胞外基质代谢酶的改变,为寻找该药物抑制新生内膜形成的作用靶标提供实验依据。实验结果如下:2.1旋覆花素对血管新生内膜中OPN表达的抑制作用OPN作为去分化型VSMC的标志蛋白,在VSMC粘附和向内膜下迁移过程中发挥着重要的作用,其表达量与细胞的迁移能力大小有着密切的关系。免疫组化结果发现,对照组主动脉壁偶见OPN阳性染色细胞;OPN阳性细胞在模型组新生内膜处有大量表达;在给旋覆花素的治疗组表达显著降低。Western blot结果也得到相似结果。提示,旋覆花素可以抑制新生内膜细胞OPN的表达。2.2旋覆花素对血管新生内膜中ICAM-1表达的抑制作用作为介导白细胞、单核/巨噬细胞以及血小板向血管损伤部位趋化、聚集和与内皮细胞粘附的关键性刺激因子,细胞间粘附分子-1(ICAM-1)在动脉粥样硬化形成早期和血管损伤后修复过程中具有重要的作用。免疫组化和Western blot分析结果显示,对照组主动脉壁偶见ICAM-1阳性染色细胞;ICAM-1阳性细胞在模型组新生内膜处有大量表达;在给旋覆花素的治疗组表达显著降低。提示,旋覆花素可以抑制新生内膜细胞ICAM-1的表达。2.3旋覆花素抑制球囊损伤后血管壁ILK的表达ILK是介导粘附分子信号经整合素跨膜转导至细胞内,并继续向下游传递的关键性信号分子。为了探讨旋覆花素抑制OPN和ICAM-1表达的生物学意义,本实验进一步观察了ILK在血管新生内膜中的含量变化。Western blot结果显示,在对照组仅有少量ILK存在;模型组ILK的表达明显被上调;旋覆花素治疗组ILK的表达虽然比对照组显著增加但仍明显低于模型组,ILK在三个实验组血管壁中的表达变化与OPN和ICAM-1的变化趋势具有一致性。以上结果提示,旋覆花素具有抑制粘附分子表达和抑制粘附分子信号传递的作用。2.4旋覆花素抑制球囊损伤后血管壁MMP-2/TIMP-2的表达细胞外基质对于VSMC的迁移发挥着重要的调节作用。MMP-2和TIMP-2在调节细胞外基质转换、平衡细胞微环境稳态的过程中起重要作用。本实验用含明胶的SDS-PAGE检测损伤血管组织的MMP-2活性,明胶酶图结果显示,在分子量为64kD的位置上形成一条透明区带,表明检测的明胶酶主要为MMP-2的活性形式。与对照组相比,模型组中MMP-2活性显著升高,旋覆花素可以明显降低MMP-2的活性。本实验还发现,TIMP-2的表达情况与MMP-2的改变趋势具有一致性,证明MMP-2的增多不是由于其抑制剂减少而导致的。可见,旋覆花素抑制MMP-2和TIMP-2的表达与活性是其抗内膜增生作用的一个方面。3旋覆花素促进血管内皮剥脱诱导的新生内膜细胞凋亡血管平滑肌细胞增殖与凋亡速率之间的平衡失调是造成血管平滑肌细胞异常堆积的重要原因之一。本部分实验分别以体外培养的血管平滑肌细胞和球囊损伤后血管再狭窄模型为研究对象,从离体和在体两个角度分别观察旋覆花素对凋亡相关基因变化的影响,以期从细胞凋亡角度阐明旋覆花素发挥抑制血管内膜增生的作用机制。实验结果如下:3.1旋覆花素对新生内膜细胞DNA断裂的影响为了探讨旋覆花素与细胞凋亡的关系,本实验应用TUNEL染色显示凋亡细胞核内断裂DNA片段。结果发现,给旋覆花素的治疗组不仅在新生内膜中出现大量TUNEL阳性细胞而且在中膜中也有较为广泛的分布,并且无论在分布范围还是着色程度上均比模型组增强。可见,旋覆花素能促进内皮剥脱诱发的新生内膜细胞大量凋亡。3.2旋覆花素对血管新生内膜中凋亡相关基因表达的影响为了检测旋覆花素对新生内膜细胞凋亡的影响,本研究采用免疫组化的方法观察了与凋亡关系最为密切的Bcl-2、Bax基因的表达变化。结果表明,Bcl-2阳性细胞主要沿新生内膜分布,其在模型组明显增多,在旋覆花素治疗组数量则显著减少。Bax则呈现相反的改变。从Western blot分析中可以看出,模型组Bcl-2表达增多、Bax减少;给旋覆花素治疗组Bcl-2的表达减少、Bax增多。以上结果提示,旋覆花素通过上调促凋亡基因Bax、下调抗凋亡基因Bcl-2表达的方式,发挥促进细胞凋亡的作用。3.3旋覆花素对血管新生内膜中Caspase-3表达的促进作用Caspase作为执行凋亡程序的一种关键酶在细胞凋亡过程中扮演着重要的角色。为了探讨Caspase在旋覆花素抑制内膜增生中的作用,本实验检测了Caspase-3在损伤血管中的表达。结果发现,与模型组相比,旋覆花素治疗组新生内膜Caspase-3的着色范围和程度均明显增加。Western blot分析可见,正常组Caspase-3表达量很少,模型组Caspase-3的表达比正常组增多,Caspase-3的表达在给旋覆花素治疗组增加更为明显。这表明,旋覆花素可能通过促进Caspase-3的表达而发挥促进血管平滑肌细胞凋亡的作用。3.4旋覆花内酯通过抑制VSMC增殖而促进凋亡细胞培养实验中也证实,旋覆花内酯具有促凋亡作用,它可上调Caspase-3,下调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达,但对于促凋亡蛋白Bax的表达却无明显作用。可见,旋覆花素与其单体的药理作用靶点存在差异,旋覆花内酯的促凋亡作用主要与其抑制Bcl-2表达有关。旋覆花素可通过多层次、多途径、多靶点而发挥抗内膜增生的作用。结论1旋覆花素通过抑制内皮剥脱诱导的NF-κB活化和炎性基因COX-2表达而缓解损伤血管的炎症反应。2旋覆花素对内皮剥脱诱导的增殖相关基因C-Jun、PCNA的表达以及粘附分子OPN、ICAM-1和ILK的表达具有抑制作用,进而阻断或削弱增殖和粘附信号的转导。3旋覆花素通过抑制MMP-2、TIMP-2的表达而降低细胞外基质的转换速率,有利于减缓内膜增生的进展。4旋覆花素主要通过抑制抗凋亡基因Bcl-2表达、上调促凋亡基因Bax和Caspase-3的水平来调制抗凋亡/促凋亡过程的平衡,从而加速细胞凋亡、抑制血管新生内膜增厚。而旋覆花内酯单体对抗凋亡基因Bcl-2表达的抑制作用更明显。5旋覆花素通过多层次、多途径、多靶点的作用而发挥抗内膜增生效应。