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姬松茸(Agaricus brasiliensis,是一种珍稀的药食两用真菌,具备多种生物活性,如免疫调节,抗癌,保肝,护肾,抗糖尿病,抗氧化,抗焦虑等。研究表明,姬松茸所含多糖在其免疫调节活性方面具重要意义,其作用机理尚待进一步研究。本论文综合采用多种分离技术及分析手段制备姬松茸多糖并进行结构鉴定,以小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞为研究对象,通过研究姬松茸多糖对RAW264.7细胞的增殖作用、吞噬作用、NO释放作用、炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)、Cox-2、NF-κB、TLR4、MYD88和TRIF mRNA表达水平、IκBα蛋白磷酸化水平的影响来探究姬松茸多糖的免疫调节作用及其相关机制,以期为姬松茸多糖开发利用提供新的理论依据,主要研究结果如下: 1.采用微波法提取姬松茸多糖,并采用大孔吸附树脂、离子交换树脂、分子筛色谱等方法进行纯化,最终得到姬松茸多糖样品。采用苯酚-硫酸法测得姬松茸多糖含量为99.5%(以葡萄糖计)。高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD法)和紫外可见吸收光谱法纯度鉴定结果表明姬松茸多糖样品纯度较高。运用排阻色谱法,根据姬松茸多糖样品的保留时间计算得姬松茸多糖的分子量为1150KDa。 2.运用HPLC柱前衍生化法确定姬松茸多糖的单糖组成,结果表明姬松茸多糖样品的单糖组成主要为葡萄糖(占比99%以上),另外还有少量的半乳糖和甘露糖。红外光谱显示姬松茸多糖具有多糖的特征吸收峰,包括O-H、饱和C-H、C=O、C-H、O-H等化学键伸缩振动的吸收峰,以及C-OH和C-O-C糖苷键伸缩振动引起的环振动所形成的多糖特征吸收峰,表示姬松茸多糖主要由吡喃糖组成。运用核磁共振波谱法(1H NMR)进一步分析姬松茸多糖的结构,显示姬松茸多糖主要由β构型吡喃糖组成,并含有β-葡萄糖结构。 3.MTT试验结果表明给药24h和48h之后,姬松茸多糖可以明显提高小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞增殖率,该作用呈现一定的时效和量效关系。中性红试验研究表明6.25μg·mL-1、12.5μg·mL-1、25μg·mL-1、50μg·mL-1浓度的姬松茸多糖作用RAW264.7细胞24h和48h后,可以极显著增强RAW264.7细胞的吞噬作用,吞噬率全部高于125%(以空白对照组为100%)。Griess试验结果表明不同浓度姬松茸多糖作用RAW264.7细胞24h和48h后,细胞NO释放量极显著增大,分别为3.78-7.70μM(空白为0.38μM)、15.22-17.58μM(空白为0.53μM)。上述试验结果表明,姬松茸多糖可以促进RAW264.7细胞的增殖作用、吞噬作用、NO释放作用,具有一定的免疫调节作用。 4.姬松茸多糖作用RAW264.7细胞24h后,炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)和Cox-2mRNA相对表达量显著升高,且表现一定的量效关系,而NF-κB、TLR4、MYD88和TRIF mRNA相对表达量无明显变化。试验结果表明姬松茸多糖可能参与了NF-κB相关通路,同时通过该通路促进炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)和Cox-2mRNA的表达。 5.Western B lot分析结果表明姬松茸多糖能够增强RAW264.7细胞中IκBα蛋白的磷酸化水平,在45min时达到最高(0-120min),结果表明姬松茸多糖可能通过调节巨噬细胞的NF-κB信号转导途径从而起到免疫调节作用。