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清道夫受体-A(Scavenger receptor A,SR-A)是一种跨膜糖蛋白受体,分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和胶原样巨噬细胞受体(MARCO)等4型,主要分布在各类组织器官的巨噬细胞上,尤其是肝脏枯否氏细胞(Kupffer cells, KCs)和脾、淋巴结的巨噬细胞上,是巨噬细胞表面重要的防御性受体,能与细菌脂多糖(LPS,内毒素的重要成分)结合,在介导巨噬细胞对细菌内毒素清除和灭活等机体防御反应中起重要作用。急性梗阻性化脓性胆管炎(Acute obstructive suppurative cholangitis, AOSC)是肝胆外科常见疾病,易导致脓毒症、感染性休克和多器官功能衰竭综合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)。对AOSC的治疗以手术尽早解除梗阻,减压引流胆道为主。其术后仍有较高的死亡率,与脓毒症继续发展以及并发MODS有关。因此术后正确、有效的治疗仍十分重要。KCs是位于肝血窦内的固定型巨噬细胞,数量庞大,其表面存在多种LPS受体。由于KCs与从肠道进入门静脉血的LPS密切接触,因此它在机体清除细菌及内毒素的防御方面以及通过释放各种细胞因子等介导MODS,尤其是内毒素性肝损伤方面都起重要作用。内毒素血症时单核巨噬细胞脂多糖受体CD14和SR-A表达的研究目前已成众多学者关注的课题,SR-A在机体防御系统中的作用也逐渐被人们认识。SR-A与LPS的结合可能是正常情况下单核巨噬细胞清除LPS的一条重要的非炎性途径。而肝组织内KCs表面SR-A表达下调、CD14表达上调可能是内毒素血症过程中,KCs由防御性细胞转化为效应性细胞的重要机制。目前肝组织中KCs表面的SR-A在AOSC时表达的变化以及与炎症介质产生、内毒素性肝损伤的相互关系的研究尚未见报道。本课题拟从肝胆外科较为常见的AOSC入手,通过建立大鼠胆管炎动物模型,进一步从组织细胞、分子、基因水平等不同层面揭示AOSC时肝组织中SR-A的表达及其意义。目的:观察AOSC时大鼠肝组织中清道夫受体的表达及其与炎症介质的产生、内毒素性肝损伤的关系。探索除外科手术外,通过调控KCs的功能特别是调控SR-A的表达来治疗脓毒症和MODS的理论依据,为AOSC的进一步治疗提供新的思路。方法:将Wistar大鼠随机分三组,第一组为急性胆道感染(AOC)组:通过结扎大鼠胆总管、于胆总管内注入大肠杆菌O111B4建立急性胆管炎动物模型;第二组为胆总管结扎(BDL)组:结扎胆总管并注射等量生理盐水;第三组为仅行开关腹手术的假手术(SO)组。于术后0h、3h、6h、12h、24h活杀动物取材。采用鲎试剂基质偶氮显色法测定不同组不同时相点血浆中内毒素含量;同时以酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆中细胞因子TNF-α及IL-6的变化;应用免疫组织化学(IHE)、逆转录多聚酶链反应法(RT-PCR)分别检测不同时相肝组织中SR-A蛋白及mRNA的表达;光镜观察肝组织病理变化;统计学分析:实验数据以平均值±标准差(±s)表示,SPSS10.5统计软件进行统计分析,AOC组分别与BDL组、SO组进行比较。组间比较采用t检验。结果:1.血浆内毒素含量变化:AOC组在术后3h血浆内毒素含量就已明显升高,并随处理时间的延长其含量逐渐增加,在24h时( 0.784±0.097Eu/ml )仍呈上升趋势,与BDL、SO组(分别为0.078±0.012Eu/ml、0.065±0.004Eu/ml)比较,差异非常显著(P<0.01)。BDL组在24h时血浆内毒素水平轻度升高而SO组各时相点内毒素含量无明显变化。2.血浆TNF-α和IL-6水平的变化:AOC组血浆TNF-α在术后3h升高明显;IL-6则在术后3 h起开始升高,6h后才显著增高。两者均随处理时间的延长其含量继续增加,在24h时分别为579.2±81.1pg/ml、520.4±78.4pg/ml。与BDL、SO组(分别为66.3±8.9pg/ml、47.7±6.8pg/ml和124.7±20.6pg/ml、105.9±14.7pg/ml)比较,差异非常显著(P<0.01)。BDL组在12h和24h时相点TNF-α轻度升高、24h时相点IL-6轻度升高。SO组各时相点TNF-α和IL-6含量无明显变化。3.免疫组化染色显示:棕黄色的SR-A免疫组化染色阳性物质主要定位于KCs胞膜。AOC组0时相点和BDL、SO组的各个时相点肝组织中SR-A的表达呈弥漫性分布;而AOC组在术后3h SR-A的表达开始下降,随着处理时间延长,棕黄色物质逐渐减少,在24h(18±2mcp/HP)时非常明显,与BDL、SO组(131±16mcp/HP、128±19mcp/HP)比较,差异非常显著(P<0.01)。4.肝组织中SR-A mRNA的表达:RT-PCR显示AOC组在术后3h,SR-A mRNA的表达已开始下降,随着处理时间延长,SR-A mRNA的表达逐渐下降,在24h时相对表达量(0.138±0.019)与BDL组、SO组(0.611±0.077、0.586±0.076)比较,差异非常显著(P<0.01)。BDL、SO组无明显的SR-A mRNA表达的改变。这就从基因水平进一步说明了SR-A mRNA表达变化与免疫组化染色的结果-蛋白表达的变化的一致性,即随着血浆内毒素水平的升高,SR-A蛋白和基因的表达均下降。5.肝组织病理变化:光镜下AOC组可见随着处理时间延长而逐渐加重的肝组织损伤,至24h时,肝血窦扩张明显,大量炎症细胞浸润,出现大面积的肝细胞变性坏死;BDL组仅有轻度改变;SO组无变化。结论:1.在AOSC过程中,随着血浆内毒素水平的逐渐增加,肝组织KCs表面SR-A的表达进行性下调,对LPS的清除、灭活作用下降,内毒素对KCs的激活作用则相应增强,这可能是脓毒症或内毒素血症过程中,KCs由防御性细胞转化为效应性细胞的重要机制之一。2.肝组织KCs表面SR-A表达的下降,可能与AOSC时的内毒素性肝损伤有关。