研究背景:唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC),亦称涎腺腺样囊性癌,是头颈部一个重要的上皮源性恶性肿瘤,约占唾液腺恶性肿瘤的21-24%以及头颈部恶性肿瘤的1%左右。本病病程虽然进展缓慢但局部侵袭能力很强、血行性转移率高,容易侵犯周围神经和脉管,具有较高的复发率及远处转移率,尤其是易转移至肺部、骨及肝脏,其远处转移率可高达40%,被描述为头颈部最具有破坏性及最难以预测的肿瘤之一。虽然目前手术完全切除和辅助化疗己被证明可改善患者的长期生存率,但腺样囊性癌的预后仍然较差,局部复发及远处转移仍时有发生,即使是经过了根治性的手术切除及综合序列治疗后,或是原发部位已经得到良好控制后。腺样囊性癌的恶性增殖、转移对其复发具有重要影响,因此,寻找控制腺样囊性癌增殖的作用靶点,对其治疗、预后具有重要意义,而有丝分裂是真核细胞主要的增殖方式。有丝分裂异常是大多数恶性肿瘤发生的共同特征。纺锤体和动粒相关蛋白复合体亚基-1,或称为纺锤体与动粒相关蛋白-1(the spindle and kinetochore-associated complex subunit 1,SKA 1)的是一个新近发现的与有丝分裂相关的基因。SKA1蛋白定位于有丝分裂期间纺锤丝和外动粒界面,参与构成的纺锤体与动粒相关蛋白复合体(spindle and kinetochore associated complex,SKA复合体),是有丝分裂期间动粒与微管形成稳定结合所必需的组成部分。SKA复合体具有许多重要的功能,其能够调节微管的解聚,从而牵动姐妹染色单体的极向移动,确保有丝分裂的顺利完成。SKA复合体还具有沉默纺锤体检测点的功能,SKA复合体或其成员的损耗能够导致染色体排列不整齐或排列延迟,从而使检测点依赖的有丝分裂阻滞于分裂中期。研究发现,通过小分子RNA干扰的方式减少SKA1的表达后,虽然不会明显改变着丝粒的形态和结构,但会导致微管连结缺陷及染色体中期板集合延迟,引起严重的染色体分离缺陷。可见,SKA1及SKA复合体是确保有丝分裂顺利完成的关键组件,在真核细胞有丝分裂过程中发挥着重要作用。目前的研究表明SKA1与肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、恶性神经胶质瘤、非小细胞肺癌以及前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。采用RNA干扰技术沉默SKA1基因的表达后,发现上述恶性肿瘤的细胞增殖能力、克隆形成能力均明显下降,多数肿瘤的细胞周期也发生明显变化。多变量生存分析发现SKA1高表达是甲状腺乳头状癌淋巴结无瘤生存及远处转移无瘤生存的独立预后因素。也有研究发现,SKA1在肿瘤细胞中的表达与p21、ERK2、Bcl-2、Bax和磷酸化Akt等多个因子的表达相关。此外,SKA1与化疗药物顺铂的耐药也密切相关。上述研究表明,SKA1可能是通过多种机制影响肿瘤的恶性增殖及发生发展。提示SKA1基因有望成为一种新的肿瘤预后标志分子或肿瘤基因治疗的新靶点,对其进行RNA干涉,有可能成为肿瘤基因治疗的有效手段。目前,有关SKA1在头颈部腺样囊性癌中的相关作用尚未见有报道。本研究拟通过检测SKA1蛋白在头颈部腺样囊性癌组织中的表达,分析其与腺样囊性癌临床病理特征及预后的相关性;并进一步探讨SKA1在腺样囊性癌细胞恶性增殖、细胞周期及转移侵袭中的分子机制,以期为临床治疗及预后判断提供具有参考价值的科学理论依据。第一部分SKA1在头颈部腺样囊性癌中的表达及临床意义的研究研究目的:检测SKA1在头颈部腺样囊性癌组织中的表达,分析SKA1表达的临床意义。研究方法:1.病例选择:本研究选取了聊城市人民医院2005年至2013年期间42例头颈部腺样囊性癌的石蜡包埋组织(其中40例纳入随访研究)。同时收集20例癌旁组织作为对照组。所有患者术前均未进行放射治疗、化疗、激素治疗以及其他任何抗肿瘤治疗。经两名不知晓临床病理资料的病理医师确诊为腺样囊性癌的样本纳入研究。2.免疫组化评估SKA1蛋白的表达:采用免疫组织化学SV(SuperVision)法判断ACC肿瘤组织组及癌旁正常组织组中SKA1蛋白的表达情况。免疫组织化学染色结果按照阳性细胞所占的百分比以及着色的深浅强度来进行综合判断。1)按照阳性细胞数占同类细胞数的百分比,可分为四组:①位于0-5%之间,为0分;②位于6-20%之间,为1分;③位于20-60%之间,为2分;④位于60-100%之间,为3分。2)按照阳性细胞的着色程度来判定评分:①细胞呈浅黄色显色为0分;②细胞着色黄色为1分;③细胞着色为棕黄色定为2分;④细胞着色为红褐色记为3分。总体评分=阳性细胞百分比评分×细胞着色强度评分,将0-1分定为阴性(-);2-4分计为阳性(+);>4分计为强阳性(++)3.统计学方法:采用SPSS 16.0统计软件对各临床变量数据进行统计分析,组间比较采用Pearson卡方检验,病例数n≤1者采用Fisher确切概率法,以(P<0.05)为具有显著性差异。研究结果:1.SKA1在腺样囊性癌组织中的表达分布SKA1在腺样囊性癌组织中的阳性表达主要分布于肿瘤细胞内,包括导管细胞和变异肌上皮细胞,而肿瘤间质内未见明显着色。SKA1在腺样囊性癌癌细胞中的阳性表达表现为胞浆及/或胞核中的黄色或棕黄色颗粒沉淀。大部分阳性病例表现为胞核及胞浆均有着色,但细胞核着色强度更明显;个别病例则表现为仅胞浆存在着色。SKA1在腺样囊性癌组织中的表达明显高于其在癌旁正常组织中的表达,组间比较具有显著性差异(P<0.05)。2.SKA1的表达与腺样囊性癌临床病理特征及预后的关系临床资料统计分析表明,SKA1的表达在腺样囊性癌TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期患者的阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05),在SACC实性型中的表达水平明显高于筛孔状/管状型(P<0.05)。SKA1的表达与患者性别、年龄、有无淋巴结转移、有无神经侵袭以及患者5年生存率无明显相关,差别无统计学意义。40例患者的5年生存率为52.5%。结论:SACC肿瘤组中高表达SKA1蛋白,且在晚期患者及实性组织病理类型中表达明显增高,检测SKA1的表达有助于头颈部腺样囊性癌的诊断、治疗和预后判断。第二部分SKA1调控涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83增殖与转移的分子机制研究目的:验证慢病毒介导的shSKA1是否能有效沉默涎腺腺样囊性癌细胞SKA1基因的表达,探讨SKA1调节头颈部腺样囊性癌恶性增殖及转移侵袭的分子机制。研究方法:1.慢病毒感染及感染效率评估:涎腺腺样囊性癌SACC-83细胞被分为三组:Con组(空白对照细胞)、Lv-shCon组(阴性对照组/无义序列慢病毒感染的细胞组)和Lv-shSKA1组(靶向SKA1的慢病毒感染细胞组)。按照MOI=10,分别加入Lv-shSKA1慢病毒和Lv-shCon阴性对照慢病毒。感染3天,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,评估慢病毒对于腺样囊性癌SACC-83细胞的感染效率。2.荧光实时定量 PCR(Real time PCR,qRT-PCR)检测 SKA1 mRNA 的表达:按说明Trizol 1 ml提取总RNA,紫外分光光度法测定260 nm和280 nm两个波长处的光吸收,计算RNA浓度,逆转录反应,β-actin为内参基因行PCR反应,按照2-△△Ct法取RQ值(RQ=2△△Ct)对基因表达进行相对定量。3.Westernblot检测SKA1沉默后相关蛋白的表达:收集各组SACC细胞,观察细胞生长状态良好,细胞融合率达到80%以上,常规进行细胞裂解和蛋白提取,以及样品蛋白浓度测定。SDS—聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)、转膜、加入一抗及二抗,按照ECL蛋白印迹显色试剂盒使用说明进行化学发光。4.MTT实验检测细胞增殖:MTT法检测SKA1基因沉默后对腺样囊性癌细胞增殖的影响,酶标仪测定595nm处的吸光值(OD595nm),以时间为横轴(X轴),光吸收值为纵轴(Y轴),绘制肿瘤细胞生长曲线。5.流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)检测细胞周期:收集慢病毒感染的处于对数生长期的各组SACC细胞,按要求处理后PI(碘化丙啶)染色,过滤,上机,检测各组细胞的细胞周期分布。6.细胞伤口愈合实验(Wound healing assay)检测细胞迁移能力:分别收集处于对数生长期的各组SACC细胞,计数后接种到24孔板,常规培养至细胞单层融合,划痕,无血清培养基继续常规培养24 h后测量划痕距离。7.细胞侵袭实验(Transwell小室)检测细胞侵袭能力:按要求处理各组细胞后接种到已铺胶的Transwell小室,常规培养24 h后甲醇固定,0.1%结晶紫染色贴附在膜下室面的细胞,计数随机选取的5个高倍视野(40×)内的细胞。研究结果:1.免疫荧光显微镜下GFP阳性细胞计数结果显示无义序列慢病毒感染的细胞组(Lv-shCon组)和目的基因RNAi靶点慢病毒感染的细胞组(Lv-shSKAl组)的感染效率均高于80%。qRT-PCR和Western blot检测结果显示,Lv-shSKAl组中SKA1的mRNA和蛋白表达水平均显著低于Lv-shCon组。2.免疫印迹结果显示,沉默SKA1的表达后与腺样囊性癌细胞周期及转移侵袭相关的各种蛋白出现异常表达。表现为p27蛋白的表达上调,CDK4、Cyclin D1,Cyclin E1,CyclinB1 及 Ndc80 蛋白的表达下降;E-cadherin 表达上升而N-cadherin和MMP-9表达下调。3.MTT试验结果显示,与正常对照组和阴性对照慢病毒感染组相比,腺样囊性癌SACC-83细胞的Lv-shSKAl慢病毒感染组的细胞生长受到显著抑制。4.流式细胞术显示,SKA1基因被沉默后,SACC-83细胞的细胞周期阻滞于S期。5.细胞伤口愈合实验检测结果显示,Lv-shSKAl慢病毒感染组细胞迁移距离明显小于未转染组SACC-83细胞和Lv-shCon组细胞。6.Transwell小室体外侵袭实验结果显示,Lv-shSKA1慢病毒感染组的细胞穿过Matrigel胶贴附在膜下室面的细胞数明显少于正常对照组和阴性对照病毒感染组。结论:1.敲减SKA1基因在头颈部腺样囊性癌中的表达,可使细胞周期细胞周期阻滞于S期,有效抑制肿瘤细胞的增殖。2.SKA1基因沉默可下调细胞周期相关基因Ndc80,CDK4,Cyclin D1,Cyclin El,CyclinBl的表达而促进p27蛋白的表达,进而阻滞细胞周期进程而细胞生长。3.敲减SKA1基因可促进E-cadherin但抑制N-cadherin的表达,抑制细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生,降低基质金属蛋白酶(MMP-9)的表达,抑制其对基底膜及细胞外基质的降解能力,达到其抑制腺样囊性癌细胞转移侵袭的目的。4.SKA1基因是头颈部腺样囊性癌肿瘤基因治疗的潜在新靶点。创新点:1.首次探讨了头颈部腺样囊性癌组织中SKA1的表达水平及其表达与患者临床病理特征及预后的相关性,发现SKA1在腺样囊性癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,且其阳性表达与临床晚期及实性型病理类型关系密切,提示SKA1可预测患者的不良预后。2.SKA1能够改变与细胞周期相关的蛋白,如Ndc80,CDK4,CyclinD1,Cyclin E1,CyclinB1及p27的表达,促进腺样囊性癌细胞的恶性增殖,并能够影响MMP-9及E-cadherin和N-cadherin的表达,促进迁移侵袭,相关研究未见报道。