遗传性牙龈纤维瘤病(Hereditary gingival fibromatosis, HGF)又名家族性或特发性牙龈纤维瘤病,是一种罕见的以牙龈组织弥漫性、渐进性增生为主要特点的良性病变。该病的国外发病率为1/175000,而在国内尚无确切报道。此病大多存在家族聚集性,为常染色体显性或隐性遗传,发病率无性别差异,偶有散发病例报道。该疾病具有高度的遗传异质性,不同的家系存在不同的致病基因,现有文献报道的基因定位分别有2p21-p22(GINGF1, MIM#135300);5q13-q22(GINGF2, MIM60554);2p22.3-p23.3(GINGF3, MIM609955);以及2007年在中国HGF家系中将致病基因定位于11p15(GINGF4,MIM611010)。除了以上报道的基因定位外,亦有文献报道利用连锁分析发现HGF的致病基因可能在染色体7、10、13、15、16、17、19和20上。SOS1基因(Son of sevenless homolog1)是目前被成功克隆与鉴定的HGF致病基因之一,已有研究证实,SOS1基因突变产生的SOS1蛋白可持续地激活ERK信号通路,上调了细胞周期调控因子,使得HGF的牙龈成纤维细胞增殖加快。SOS1基因突变导致HGF牙龈成纤维细胞显著增生为该疾病的可能病理机制之一。根据HGF的病理学特征,学者将该疾病致病机制的研究重点集中在分析相关细胞的增殖情况以及引起细胞外基质(Extracellular matrixc, ECM)过度堆积的相关细胞因子,由于疾病的遗传异质性,不同研究者所得结果存在差异。本研究通过收集HGF患者家系和散发病例,分析其临床特点,利用分子生物学、细胞学和组织学的方法,对该疾病的致病机制进行初步研究,以期探讨中国HGF患者的临床及致病基因特点。本文内容共分为三部分：一、遗传性牙龈纤维瘤病患者SOS1基因突变检测目的：通过收集遗传性牙龈纤维瘤病患者临床病例,分析其临床特点以及检测其家系中SOS1基因突变情况,探究中国HGF患者的可能致病基因。方法：收集了遗传性牙龈纤维瘤病病例1名散发病例患者和来自同一家系的3名患者,患者均来自广东省口腔医院牙周科门诊。散发病例患者为女性,10岁,在其2岁以前出现牙龈增生症状,除了影响日常饮食及美观,同时严重地阻碍了恒牙的发育,该患者为早发性遗传性牙龈纤维瘤病。家系中的先证者于2009年因牙龈增生影响日常饮食及美观就诊,其后先证者的哥哥和叔叔在2013年因同样原因前来就诊。分别对患者进行口腔专科检查和全身健康检查,并询问患者的用药史和患病史；询问和记录家系中各成员的现病史、系统性疾病史、胎儿期及婴幼儿期患病史和药物接触史等；对家系中各成员进行全身健康状况及口腔专科检查,了解相应病史及疾病在家系中的遗传特征,对受累成员的年龄、性别、临床表现、X线特点进行详细记录和分析。取患者及正常人的牙龈组织进行HE染色和Masson染色,比较组织学改变。抽取患者静脉血,提取全血基因组DNA,通过Primer Premier6进行引物设计,利用20对引物PCR扩增SOS1基因24个外显子,双向直接测序,BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool)同源序列分析,检测基因突变位点。结果：临床特点：4名患者口内牙龈均广泛增生,累及全口的龈缘、龈乳头和附着龈,覆盖大部分牙冠；增生牙龈的颜色正常,组织坚韧,点彩明显。患者牙龈组织的增生严重程度存在个体差异。病理改变特点：牙龈组织HE染色显示患者的牙龈上皮增厚,上皮钉突延长,深入结缔组织；结缔组织中有丰富的胶原纤维,成纤维细胞和血管较少,偶有炎症细胞侵润。牙龈组织Masson染色显示患者的牙龈结缔组织中有粗大的、排列整齐的胶原纤维束,其胶原成分明显丰富于正常人,而成纤维细胞较正常人稀少。致病基因检测：通过PCR扩增SOS1基因的外显子并进行测序,利用同源性比较分析(BLAST),尚未在患者中发现有突变位点存在。结论：本研究所收集的病例其临床表现符合遗传性牙龈纤维瘤病的诊断标准,并通过组织学检测证实了患者牙龈组织的病理改变；患者的HGF表型可能由SOSl基因以外的其他致病基因突变所致,需要进一步筛选。二、遗传性牙龈纤维瘤病患者的牙龈细胞学特征目的：通过体外培养比较遗传性牙龈纤维瘤病患者和正常人的牙龈上皮细胞和成纤维细胞的增殖及迁移,探究HGF致病机制的可能细胞生物学基础。方法：利用Dispase Ⅱ酶消化牙龈组织,使牙龈上皮层从基膜处与结缔组织完整分离,再使用0.25%胰酶消化上皮组织,使牙龈上皮细胞分散成单个细胞,有利于细胞的贴壁生长,缩短了培养时间。Dispase Ⅱ酶消化后,分离余下的结缔组织可通过组织块贴壁法培养出牙龈成纤维细胞。细胞培养的标本来自于HGF患者经牙龈切除术治疗时取得新鲜的牙龈组织,同时设定对照组,年龄相近、性别相同的牙龈健康正常人拔除阻生牙时切除的新鲜牙龈组织。体外培养的原代细胞通过免疫组化标记波形丝蛋白和细胞角蛋白进行来源鉴定,分别对分离出来的牙龈上皮细胞和成纤维细胞进行免疫组织化学染色。利用MTT方法,分别对HGF患者和对照组的牙龈上皮细胞和成纤维细胞作生长周期实验,比较细胞的体外增殖情况。利用细胞划痕实验,比较细胞的体外迁移速度。结果：形态学上观察,HGF患者和对照组没有明显区别。体外培养的牙龈上皮细胞呈多角形,铺路石样排列,核大,典型上皮细胞形态；体外培养的牙龈成纤维细胞呈长梭形、纺锤形,两极突起较长,细胞核圆形或椭圆形,位于胞体中央,细胞形态规律,呈鱼群样生长。细胞来源鉴定,牙龈上皮细胞为波形丝蛋白染色阴性,细胞角蛋白染色阳性；牙龈成纤维细胞为波形丝蛋白染色阳性,细胞角蛋白染色阴性,符合细胞来源鉴定标准。HGF的牙龈上皮细胞和成纤维细胞的增殖情况与对照组相比无明显变化；在细胞迁移实验中,未发现HGF的牙龈上皮细胞和成纤维细胞其迁移速度与对照组有差别。结论：体外成功地分离培养了牙龈上皮细胞和牙龈成纤维细胞。HGF患者的牙龈上皮细胞和成纤维细胞在增殖和迁移能力与正常人比较未发现显著异常,提示牙龈细胞的增殖及运动的变化可能与HGF的发病关系密切程度不高,进一步探究与胶原、ECM大量合成堆积有关的基因表达,可能会有助于揭示其致病机制。三、遗传性牙龈纤维瘤病患者的牙龈组织学特征目的：通过比较纤维化相关因子(TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,CTGF,EGFr)在遗传性牙龈纤维瘤病和正常人的牙龈组织以及体外培养细胞中的表达差异,拟阐述HGF发病机制相关的细胞学病理基础。方法：HGF患者和对照组的牙龈上皮细胞和牙龈成纤维细胞经体外培养,制作细胞爬片,利用中性福尔马林固定,-20℃冰箱保存。HGF患者和对照组的新鲜牙龈组织使用中性福尔马林固定后,经梯度酒精脱水,经二甲苯透明,石蜡浸蜡后包埋成石蜡块。石蜡块标本经切片、展片、贴片、二甲苯脱蜡、梯度酒精脱蜡至亲水组织切片。细胞爬片和组织切片利用免疫组织化学的方法,经非特异阻断剂封闭、标记一抗、孵育二抗、DAB显色步骤染色。通过显微镜观察纤维化相关因子在HGF患者和对照组的细胞及牙龈组织中的表达。通过Image-Pro Plus6.0图像分析系统对染色组织切片进行半定量分析,采用SPSS13.0统计分析软件对数据进行统计学评价,使用独立样本t检验方法。结果：牙龈组织切片的免疫组织化学检测表明,HGF患者与对照组相比,TGF-β1在结缔组织中的表达显著上升(t=4.561,P=0.01),在上皮层的表达无显著变化(t=1.690,P=0.166)；TGF-β2在结缔组织中未发现有表达,在上皮层的表达显著下降(t=-7.156,P=0.019)；TGF-β3未发现在结缔组织中有表达,在上皮层的表达无显著变化(t=2.278,P=0.147):CTGF在结缔组织的表达变化无统计学意义(t=2.426,P=0.072),而在上皮层的表达显著高于正常人(t=9.581,P=0.001):EGFr在结缔组织中无表达,在上皮层的表达显著升高(t=5.753,P=0.005)。体外细胞爬片免疫组化结果表明：体外成纤维细胞中,TGF-β3的表达在HGF患者显著高于正常对照组(t=5.328,P=0.006)；EGFr仅在HGF患者中有弱表达,对照组则无表达；其他纤维化相关细胞因子的表达差异均无统计学意义。体外上皮细胞中,纤维化相关因子(TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,CTGF, EGFr,)在两组细胞中的表达差异均无统计学意义。结论：体内牙龈组织内纤维化相关因子的表达差异,提示细胞外基质的过度合成和堆积可能为HGF发生的重要病理机制；而体外培养细胞的相关因子表达改变,提示上皮-结缔组织的相互作用及信息传递可能在HGF发病中起着核心作用,进一步探究HGF患者牙龈上皮-结缔组织细胞之间的相互作用,可能为其致病机制提供新的思路。