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[目的] 通过探讨原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)死亡率的发展趋势及变化规律,对HCC危险性进行研究,并进一步评价早期诊断标记物及易感基因与HCC的关系,为HCC的预防控制提供依据。 一、对HCC死亡率进行预测和时间趋势分析； 二、探讨血清细胞外蛋白激酶A(Extracellular cAMP-dependent protein kinase,ECPKA)在HCC诊断中的价值； 三、探讨PRKAR1B基因、PRKAR1A基因和survivin基因与HCC遗传易感性的关系； 四、初步探讨PRKAR1B基因、PRKAR1A基因和survivin基因多态性与血清ECPKA的关系。 [方法] 一、根据江苏省海门市1968～2007年HCC粗死亡率、1993～2007年年龄标化死亡率(standardized mortality rate,SMR)以及1993-2004年人群队列资料,分性别分别利用求和自回归移动平均(Autoregressive integrated moving average,ARIMA)模型、灰色模型(Grey model,GM)和年龄-时期-队列(Age-period-cohort,APC)模型对HCC死亡率未来发展趋势进行预测,并对时间趋势进行分析。 二、采用病例对照研究设计,利用Logistic回归模型分析血清ECPKA与HCC的关系,计算OR值及其95％可信区间。对ECPKA进行Box-Cox正态转换后,绘制受试者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲线,并计算ROC曲线下面积及其95％可信区间。将ECPKA和AFP转化为有序数据后,拟合Logistic回归模型,计算ECPKA、AFP及二者同时存在时的ROC曲线下面积及其95％可信区间,并进行两两比较。根据Youden指数最大原则,并结合Logistic回归分析结果及ROC曲线,确定最佳临界值,并评价AFP和ECPKA的联合应用价值。 三、采用限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)基因分型技术对HCC相关基因(PRKAR1B基因、PRKAR1A基因和survivin基因)进行基因分型后,对多态性位点进行关联分析(基因型、等位基因分析)和多因素Logistic回归分析;利用UNPHASED3.1.4软件,计算各配对位点间的连锁不平衡参数D;利用HAPSTAT3.1软件,计算各基因的单倍型频率,并分别在4种遗传模式(隐性、显性、相加及共显性模型)下应用Logistic回归模型估计单倍型及单倍型-单倍型、单倍型.环境交互作用与HCC的关系。 四、采用Logistic回归分析探讨基因多态性与血清ECPKA含量的关系。 [结果] 一、HCC死亡率的预测租时间趋势分析 (一)HCC总粗死亡率、男性粗死亡率及女性粗死亡率的较优的ARIMA模型分别为ARIMA(0,2,(1,9))、AMMA(0,2,1)和ARIMA(0,2,1)。根据较优模型的预测结果显示,2008～2012年HCC总粗死亡率和男性粗死亡率缓慢下降,女性粗死亡率轻微升高。 (二)根据构建的HCC SMR的GM(1,1)残差修正模型预测结果显示,至2012年,总SMR及分性别SMR均呈下降趋势。 (三)APC梯度模型拟合优度检验及模型比较结果显示,年龄-时期模型为最优模型(△G2=9.065,AIC=202.544)。APC模型的曲率估计结果显示,曲率改变显著的年龄组为36.5岁～(-0.368)和64.5岁～(-0.489),队列作用的曲率改变主要发生在1956～1959年(C21949.5,1967.5=-0.492)；年龄-时期模型的分层相对危险度估计结果显示,随年龄增加,年龄效应呈升高趋势,至64.5岁～组后开始下降;时期越晚相对危险度越低。年龄-时期模型的预测结果显示2005～2012年男性HCC死亡率呈下降趋势。 二、血清ECPKA在HCC诊断中的价值 (一)HCC病人血清ECPKA表达＞HBsAg阳性人群＞健康人群(P＜0.05),其ECPKA含量分别为(15.579±7.441)U/mL、(9.269±6.565)U/mL和(5.277±3.190)U/mL。以健康人群为对照时,ECPKA粗OR值及调整年龄和性别后OR值分别为1.48(1.37,1.59)和1.49(1.38,1.61);以HBsAg阳性人群为对照时,ECPKA粗OR值及调整OR值分别为1.13(1.09,1.17)和1.13(1.09,1.18):以健康人群+HBsAg阳性人群为对照组时,FCPKA粗OR值及调整OR值分别为1.23(1.18,1.27)和1.23(1.19,1.28)。 (二)以健康人群为对照时分析结果 1.ROC曲线下面积为0.908(0.870,0.946),与0.5相比,差异有统计学意义(P＜0.001)。 2.将ECPKA和AFP转换为有序数据后,ECPKA+AFP、ECPKA和AFP ROC曲线下面积分别为0.931(0.897,0.967)、0.895(0.858.0.932)和0.789(0.721,0.838)。ECPKA和ECPKA+AFP的ROC曲线下面积均高于AFP,u值分别为3.38(P＜0.001)和4.70(P＜0.001);ECPKA与ECPKA+AFP之间的差异无统计学意义(u=1.41,P=0.079)。 3.根据约登指数最大原则,结合Logistic回归结果及ROC曲线,选择10U/mL为ECPKA的最佳临界值,此时,灵敏度=75.25％,特异度=91.87％,阳性预测值=69.72％,阴性预测值=93.72％。 4.ECPKA和AFP分别以10U/mL和400μg/L为临界值时的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值及其联合试验分析结果显示,ECPKA(x2=12.28,P＜0.001)及ECPKA和AFP并联(x2=28.26,P＜0.001)时的灵敏度高于AFP;ECPKA与ECPKA和AFP并联时灵敏度之间的差异处于临界值(x2=3.85,P=0.050)。 (三)以HBsAg阳性人群为对照时分析结果 1.ROC曲线下面积为0.746(0.689,0.803);与0.5相比,差异有统计学意义(P＜0.001)。 2.将ECPKA和AFP转换为有序数据后,ECPKA+AFP、ECPKA和AFP ROC曲线下面积分别为0.852(0.805,0.901)、0.732(0.677,0.786)和0.781(0.730,0.831),调整年龄、性别后,ROC曲线下面积分别为0.871(0.821,0.921)、0.782(0.725,0.840)和0.838(0.784,0.891)。调整年龄、性别后,ECPKA的ROC曲线下面积低于ECPKA+AFP,u值为2.24(P=0.013);ECPKA与AFP及AFP与ECPKA+AFP之间ROC曲线下面积差异无统计学意义,u值分别为1.39(P=0.082)和0.88(P=0.189)。 3.根据约登指数最大原则,结合Logistic回归结果及ROC曲线,选择10U/mL为ECPKA的最佳临界值,此时,灵敏度=75.25％,特异度=63.68％,阳性预测值=51.01％,阴性预测值=83.66％。 4.ECPKA、AFP及二者并联时灵敏度比较结果同上。 (四)以HBsAg阳性+健康人群为对照组时分析结果 1.ROC曲线下面积为0.855(0.814,0.895):与0.5相比,差异有统计学意义(P＜0.001)。 2.将ECPKA和AFP转换为有序数据后,ECPKA+AFP、ECPKA和AFP的ROC曲线下面积分别为0.906(0.869,0.943)、0.841(0.802,0.880)和0.786(0.737.0.835),且ECPKA+AFP＞ECPKA＞AFP(P＜0.05)。 3.根据约登指数最大原则,结合Logistic回归结果及ROC曲线,选择10U/mL为ECPKA的最佳临界值,此时,灵敏度=75.25％,特异度=82.54％,阳性预测值=41.76％,阴性预测值=95.25％。 4.ECPKA、AFP及二者并联时灵敏度比较结果同上。 三、PRKAR1B基因、PRKAR1A基因和survivin基因与HCC遗传易感性关系研究 (一)基因多态位点基因型及等位基因在病例组和对照组中的分布 1.PRKAR1B基因各位点基因型及等位基因分布分析结果显示,rs3211362A/G位点基因型和等位基因在病例组和对照组间的分布均无显著性差异,检验统计量分别为x2=1.51(P=0.470)和x2=0.70(P=0.403)。rs8382G/C位点GG、GC和CC基因型在病例组和对照组间分布有显著性差异(x2=11.91,P=0.003);以GG基因型为参照,具有GC基因型者,其HCC发病风险降低(OR值为0.45(0.28,0.74));rsg382G等位基因和rs8382C等位基因在病例组和对照组间分布有显著性差异(x2=11.59,P=0.001),病例组C等位基因频率(10.23％)低于对照组(19.13％)。 2.PRKAR1A基因各位点基因型及等位基因分布分析结果显示,rs2302230A/G位点AA、AG和GG基因型在病例组和对照组间分布有显著性差异(x2=7.26,P=0.027);以AA基因型为参照,具有AG或GG基因者,其HCC发病风险升高,OR值分别为1.62(1.02,2.58)和2.92(1.03,8.29);rs2302230A等位基因和rs2302230G等位基因在病例组和对照组间分布有显著性差异(x2=7.82,P=0.005),病例组G等位基因频率(21.87％)高于对照组(14.03％)。 rs8080306A/C位点基因型在病例组和对照间分布有显著性差异(x2=6.54,P=0.038),以AA基因型为参照,具有CC基因型者,其HCC发病风险升高,OR值为2.43(1.07,5.49);rs8080306A等位基因和rs8080306C等位基因在病例组和对照组间分布有显著性差异(x2=6.14,P=0.013),病例组A等位基因频率(33.52％)高于对照组(25.26％)。 3.survivin基因各位点基因型及等位基因分布分析结果显示,rsl042489T/C位点和rs9904341G/C位点基因型及等位基因在病例组和对照组间分布均无显著性差异(P＞0.05)。 (二)多因素Logistic回归分析 1.基因多因素Logistic回归分析 多因素Logistic回归分析结果显示,以GG基因型为参照,rs8382GC基因型是HCC的保护基因型(OR值为0.42(0.25,0.70));以AA基因型为参照,rs2302230GG是HCC危险基因型(OR值为3.75(1.19,11.85));以AA基因型为参照,rs8080306AC及rs8080306CC基因型是HCC危险基因型,OR值分别为1.71(1.09,2.68)和2.97(1.20,7.32)。 2.基因-基因和基因-环境交互作用的多因素Logistic回归分析 基因-基因和基因-环境交互作用分析结果显示,rs8382GC与HBsAg阳性和饮酒存在交互作用,β值分别为2.999(P=0.036)和-3.854(P=0.010)。未发现存在基因-基因交互作用或其它基因-环境交互作用。 (三)连锁不平衡检验 UNPHASED3.1.4软件分析结果显示PRKAR1B基因rs3211362位点与rs8382位点间及survivin基因rs1042489位点与rs9904341位点间呈连锁不平衡,病例组D值分别为0.231和0.184,对照组D值分别为0.327和0.185。未发现PRKAR1A基因m2302230位点与rs8080306位点间存在连锁不平衡(病例组和对照组D值分别为0.006和0.113)。 (四)单倍型与HCC的关联分析 1.应用HAPSTAT3.1软件估计PRKAR1B基因rs3211362A/G和rs8382G/C多态位点构成的单倍型的频率。结果显示,各单倍型频率在病例组与对照组间有显著性差异(x2=12.46,P=0.006)。采用HAPSTAT3.1软件在不同遗传模式下对PRKAR1B基因各单倍型与HCC的关联进行分析,结果显示,加性模式为较优模型(AIC=1144.804)。在相加遗传模式下,以不具有A-C单倍型为参照,具有A-C单倍型者,其肝癌发病风险降低(β=-0.878,P=-0.002)。未发现其它单倍型有显著性(P＞0.05)。 2.survivin基因rs1042489T/C和rs9904341C/G多态性位点组成的单倍型的频率在病例组与对照组间差异无统计学意义(x2=2.88,P=0.410)。采用HAPSTAT3.1软件在不同遗传模式下对survivin基因各单倍型与HCC的关联进行分析。结果显示,隐性模式的AIC值最小(AIC=1491.165)。在隐性遗传模式下,以不具有T-C单倍型为参照,具有T-C单倍型者,HCC患病风险减小(β=-0.731,P=0.036)。未发现其它单倍型有显著性(P＞0.05)。3.单倍型-单倍型及单倍型-环境因素交互作用分析结果显示,未发现存在单倍型-单倍型以及单倍型-环境交互作用。 四、基因多态性与血清ECPKA关系初探 Logistic回归结果显示,各基因位点多态性与血清ECPKA含量均无关(P＞0.05)。 [结论] 一、年龄、时期和部分队列效应可较好地解释HCC死亡趋势的改变。未来几年HCC死亡率轻微下降,但仍将处于较高发病状态,早期诊断标记物的研究对HCC的防治仍具有重要意义。 二、HCC病人血清中ECPKA表达显著上调,ECPKA可能是一个新的、有价值的HCC早期诊断的替代指标;当用于人群筛检HCC时,ECPKA可能优于AFP。 三、PRKAR1B基因的rs8382G/C位点和PRKAR1A基因的rs2302230A/G位点及rs8080306A/C位点多态性可能与HCC的发病有关。PRKAR1B基因的rs3211362A-rs8382C单倍型和survivin基因的rs1042489T-rs9904341C单倍型可能为HCC保护性单倍型。Rs8382可能与饮酒和HBsAg阳性存在交互作用。 四、PRKAR1B基因、PRKAR1A基因和survivin基因多态性可能与血清ECPKA含量无关。