研究目的枸杞的水溶性多糖是枸杞发挥生物活性的主要成分,具有良好的免疫增强作用,但其免疫调节作用机制尚在探索研究中。近些年来肠道菌群研究的不断深入,为多糖等低生物利用度产品的作用机制探究提供了新的思路。枸杞多糖(The polysaccharides of Lycium barbarumL.,LBP)对肠道菌群会产生怎样的影响以及其与免疫功能之间是否存在相关性,目前尚不清楚。本研究以环磷酰胺致免疫抑制小鼠和RAW 264.7细胞为模型,考察了 LBP体内外免疫功能以及对小鼠肠道菌群的影响,且结合LBP肠跨膜转运情况,以期深入探讨LBP的免疫活性及免疫调节作用途径。多糖的结构与活性有着紧密的联系,建立能反映其结构、纯度特性的多糖质控方法对于多糖产品的有效性、稳定性、均一性和安全性有重要意义。然而由于多糖结构的复杂性,导致其质控方法研究进展缓慢。本研究拟采用多种分析技术联用方式对LBP初级结构进行测定,通过构效关系分析得到影响LBP免疫活性发挥的主要结构特征,形成能反映LBP关键结构特征的质控方法,以控制和指导LBP的制备;同时结合体外免疫和抗氧化活性测定对不同产地枸杞中LBP进行比较,为我国枸杞资源质量评价提供理论基础。研究方法1、采用水提醇沉法得到枸杞粗多糖;采用苯酚硫酸-UV法测定总糖含量;咔唑硫酸-UV法测定酸性糖含量;建立PMP衍生化-HPLC-PDA法测定LBP中单糖组成及摩尔百分比;采用GPC-RI-MALLS联用法测定LBP的相对分子量(Mw)、分散系数(PDI)以及空间构象(α);采用甲基化-GC/MS法对LBP糖的连接位置进行测定。2、在LBP分离纯化过程中,分别对乙醇沉淀法、膜分离法、色谱柱分离法进行考察,以获得高纯度的均一的LBP成分。3、以人工胃液和肠液模拟体外消化状态,考察LBP在消化液中的稳定性。采用FITC对LBP进行荧光标记,再采用Caco-2细胞模型对FITC-LBP的跨膜吸收进行研究,获得表观渗透系数Papp。4、以RAW264.7小鼠单核巨噬细胞为模型,考察LBP对细胞增殖活性、吞噬能力及相关细胞因子表达量的影响;同时采用Western-blot法初步分析LBP对信号通路的影响。5、采用CTX致免疫抑制小鼠模型,考察LBP对小鼠免疫器官、巨噬细胞吞噬指数、脾脏中淋巴细胞、T细胞亚群及血清中IgG、IgM水平的影响。6、采用16S rDNAV3+V4高变区测定技术,对不同实验组小鼠肠道菌群的多样性及群落结构进行统计;同时采用Pearson统计法分析肠道菌群与免疫功能之间的相关性。采用HE染色法对小鼠肠粘膜形态进行观察。7、对不同产地(宁夏、新疆、青海)枸杞中的LBP进行提取和纯化,采用已建立的方法对其产率和初级结构进行测定,并对LBP单糖组成及糖连接方式指纹图谱进行相似度评价。同时对不同产地LBP体外免疫活性及抗氧化活性进行比较。研究结果1、LBP初级结构测定本实验所得LBP是总糖含量为66.9%的酸性杂多糖;由9种单糖组成,分别为:甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖;LBP分子量测定呈现出2个分离不完全的色谱峰,峰1的Mw为 1.37×106Da(PDI为 1.58);峰 2 的 Mw 为 8.83 × 104Da(PDDI为 1.48);α(Rg-M曲线的斜率值)为0.237,初步推断LBP在0.1%NaCl溶液中呈现紧缩的球型;LBP中主要有14种糖的连接方式,以(1→4)GalA连接为主。本实验采用的定量测定方法灵敏度高、准确性好,经方法学验证符合实验要求。2、LBP的分离纯化 采用DEAE-52纤维素柱和HW-65层析柱相结合的方法对LBP进行分离,获得两个高纯度均一成分:LBP1和LBP2,其Mw分别为1207400 Da和 125000 Da。3、LBP在体外消化液中的稳定性及肠跨膜转运能力 通过Mw测定表明LBP1和LBP2在人工胃液和人工肠液中均未发生降解;在肠跨膜转运实验中培养的Caco-2单细胞模型经验证紧密性和完整性良好,可模拟小肠上皮细胞;采用经验证标记成功的FITC-LBP1和FITC-LBP2进行Caco-2细胞跨膜转运实验,其累积转运率分别为0.99%和1.15%,Papp<1.0 × 10-6cm·s-1,说明两个LBP组分在小肠中均不易被吸收。4、LBP对巨噬细胞的免疫调节及其机制研究 LBP1和LBP2均能显著促进RAW 264.7细胞增殖,增强其吞噬能力;提高细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β和iNOS的mRNA表达量,呈剂量依赖性;同时诱导巨噬细胞p-JNK MAPKs信号通路的激活,且其激活程度随着浓度的增加而逐渐增强。在对RAW 264.7的调节作用上,LBP1效果优于LBP2(P<0.05)。5、LBP对免疫抑制小鼠免疫功能的影响 相比于模型组,LBP1和LBP2均显著提高小鼠胸腺和脾脏指数;促进脾脏中T、B淋巴细胞的增殖;提高血清中IgG、IgM的含量;同时调节CD4+、CD8+T淋巴细胞数量及CD4+/CD8+比例,均呈现剂量依赖性。在体内免疫调节功能上,LBP1效果优于LBP2(P<0.05)。6、LBP对免疫抑制小鼠肠道菌群及肠粘膜的影响 高剂量LBP1和LBP2给药组可逆转由CTX导致的肠道菌群紊乱,使OTU多样性及菌群结构恢复到对照组水平。比较不同实验组菌群结构发现:LBP可显著提高双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌、普雷沃氏菌科和理研菌科的相对丰度;降低某些菌群,如大肠杆菌,Parabacteroides和Ruminococcus的相对丰度。通过相关性分析得出:在科水平上,乳杆菌、拟杆菌、普雷沃氏菌和双歧杆菌与免疫调节呈显著正相关,而大肠杆菌、瘤胃菌科与毛螺旋菌科与免疫调节呈显著负相关。同时发现低剂量LBP组对肠道菌群无明显调节作用。此外,经LBP干预后可一定程度修复由CTX引起的小鼠肠道粘膜损伤。7、基于LBP测定的不同产地枸杞质量评价 不同产地LBP结构和体外活性具有高度相似性,且单糖组成和糖的连接位置指纹图谱相似度均大于0.90;但不同产地枸杞中LBP的产率相差较大,在1.6%～4.4%之间,青海枸杞LBP的平均产率显著低于新疆和宁夏枸杞子(P<0.05)。研究结论1、基于不同产地LBP结构共性特征及构效关系分析,初步形成了 LBP质控方法。包括对LBP中半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖四种主要单糖进行含量测定,对LBP的Mw及PDI的范围进行检查,同时以LBP单糖组成对照指纹图谱对待测LBP进行相似度分析,相似度应不得低于0.90。此法极大提高LBP检测的专属性,可有效的反映LBP关键结构属性,且检测指标与其活性密切相关,可将LBP及其相关产品与其他中药多糖进行有效区分。2、不同产地枸杞中LBP结构及体外活性具有高度一致性,但LBP产率存在较大差异。推测对于多糖成分,种属对其结构和生物活性有关键影响,而地域对多糖产率有较大影响。宁夏一直被认为是枸杞的道地产区,本研究从多糖的角度部分阐明了宁夏产区枸杞的质量优势。3、体内外实验均表明LBP具有较强的免疫调节功能。RAW264.7细胞实验表明LBP可通过激活p-JNK MAPKs细胞通路对巨噬细胞免疫调节作用产生影响;免疫抑制小鼠模型实验表明LBP可改善CTX导致的小鼠免疫器官萎缩,并从体液免疫和细胞免疫两方面增强机体免疫功能。同时发现LBP1的效果优于LBP2,说明Mw是影响LBP免疫活性的关键因素之一。4、高剂量LBP可改善免疫抑制小鼠菌群多样性,提高某些菌群的相对丰度,此类菌群或可直接激活相关免疫通路,促进T淋巴细胞的分化;或与SCFA的产生相关,可增强肠道粘液屏障功能。同时发现LBP可降低某些潜在的致病菌,而此类致病菌亦与结肠炎、结肠癌等疾病相关。5、结合LBP在Caco-2跨膜研究中转运率很低的结果,初步推测LBP进入肠道后对肠道菌群的调节作用是其发挥免疫功能的重要途径之一;低剂量LBP无明显肠菌群调节作用,说明LBP免疫作用途径与其剂量紧密相关。