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水稻是全球主要的粮食作物，利用分子生物学技术鉴定水稻基因功能对揭示植株生长发育过程中的分子调控机制意义重大。本实验室前期从水稻幼穗cDNA文库中分离了一个RhoGTP酶激活蛋白编码基因，命名为OsRhoGAP2，并利用转基因技术构建了OsRhoGAP2过表达水稻，同时前期研究显示，OsRhoGAP2基因的启动子可响应非生物胁迫和激素信号，但具体的生物学功能尚不清楚。为鉴定OsRhoGAP2在水稻生长发育过程中的功能，本文以OsRhoGAP2过表达水稻与利用CRISPR/Cas9技术构建的OsRhoGAP2编辑水稻为实验材料展开了研究。
对WT和OsRhoGAP2过表达水稻(T5-1、T5-5、T5-6)叶片表型观察发现，二者前期叶片表型无差异，在水稻抽穗后期，转基因水稻叶片正卷，统计结果显示，该时期WT与3个过表达株系的剑叶卷曲度分别为10.86%、27.38%、35.36%和31.07%，剑叶直立指数分别为95.53%、99.34%、100%和100%，过表达株系的剑叶卷曲度与叶片治理指数均极显著高于WT。水稻抽穗期剑叶石蜡切片统计结果显示，转基因水稻剑叶泡状细胞面积极显著小于WT，叶片泡状细胞甲苯胺蓝染色结果与石蜡切片统计结果一致，即转基因水稻泡状细胞染色面积比WT的小。对抽穗期水稻叶片的生理指标和光合作用相关指数进行测定发现，OsRhoGAP2过表达水稻剑叶的叶绿素水平和净光合速率显著高于WT，其气孔导度与蒸腾速率则极显著低于WT。说明OsRhoGAP2过表达可能通过影响水稻叶片泡状细胞的大小来改变叶片形态，进而影响水稻的光合作用。
对WT和OsRhoGAP2过表达水稻种子的萌发率检测发现，WT与3个过表达株系的种子萌发率分别为84.5%、62%、39.5%和28%，α-淀粉酶含量分别为13.82、10.82、9.85和9.66mg/g·min，且过表达水稻的种子萌发率与α-淀粉酶含量均极显著低于WT，说明OsRhoGAP2过表达通过下调α-淀粉酶活性抑制水稻种子萌发。用1000mg/LGA处理后，能在一定程度上缓解这种抑制。采用液质联用检测内源GA含量，结果显示，过表达水稻种子内源活性GA1、GA3与GA7的含量均显著低于WT。qRT-RCR结果显示，过表达水稻种子中的GA合成基因OsCPS1、OsKS1和OsKAO的相对表达量低于WT，GA灭活基因OsGA2ox6和OsGA2ox8的相对表达量高于WT，4种α-淀粉酶合成基因的相对表达量低于WT。说明OsRhoGAP2过表达降低水稻种子萌发率的原因可能与通过调控GA合成和灭活基因的表达，抑制活性GA生成，从而下调α-淀粉酶活性有关。
对成熟期WT和3个过表达株系的株高进行统计分析，发现二者的株高分别为92.12、86.5、86.4和89.22cm，且过表达水稻的株高极显著低于WT。进一步对节间及穗长进行统计发现，过表达水稻穗长与WT无明显差异，而其第一、二、三节间长度短于WT，差异极显著达水平。节间石蜡切片统计结果显示，过表达水稻的节间细胞长度小于WT，单位面积节间细胞数目多于WT，且差异均达到极显著水平。提示OsRhoGAP2过表达通过抑制节间细胞伸长，导致过表达水稻植株的矮化。
为采用功能缺失策略鉴定OsRhoGAP2基因的功能，本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了OsRhoGAP2基因编辑水稻，经筛选鉴定共获得两种纯合突变体(株系1和16)。序列比对显示，二者在靶位点分别缺失碱基“TC”和“T”，预期生成的分别是含149与60个氨基酸的截短蛋白，均没有典型的RhoGAP结构域。株系1中突变的OsRhoGAP2与WT的CRIB基序仅有3个氨基酸匹配，株系16中，突变的OsRhoGAP2对应CRIB基序部分完全缺失。水稻抽穗期的叶片与颖壳扫描电镜结果显示，株系1的表面缺乏表皮毛，而株系16与WT表型相似。剑叶光合作用指标检测显示，2种突变体的净光合速率、气孔导度均显著高于WT。说明OsRhoGAP2基因缺失提高了水稻的光合作用水平，并且株系1出现的光叶水稻表型提示，该基因的敲除可能还影响了表皮毛的发育过程。
本研究以OsRhoGAP2过表达水稻为实验材料，对OsRhoGAP2基因在植株生长发育过程中的生物功能进行鉴定，发现该基因功能涉及细胞生长、种子萌发、光合作用以及叶片形态等方面的调控，且与GA信号通路相关。另一方面，本文还构建了OsRhoGAP2基因敲除水稻，发现该基因敲除后不但影响水稻叶片的光合作用，还涉及到表皮毛的发育。这为后续探究OsRhoGAP2基因的调控网络奠定基础，也为揭示植物RhoGAP基因的功能提供新见解。
对WT和OsRhoGAP2过表达水稻(T5-1、T5-5、T5-6)叶片表型观察发现，二者前期叶片表型无差异，在水稻抽穗后期，转基因水稻叶片正卷，统计结果显示，该时期WT与3个过表达株系的剑叶卷曲度分别为10.86%、27.38%、35.36%和31.07%，剑叶直立指数分别为95.53%、99.34%、100%和100%，过表达株系的剑叶卷曲度与叶片治理指数均极显著高于WT。水稻抽穗期剑叶石蜡切片统计结果显示，转基因水稻剑叶泡状细胞面积极显著小于WT，叶片泡状细胞甲苯胺蓝染色结果与石蜡切片统计结果一致，即转基因水稻泡状细胞染色面积比WT的小。对抽穗期水稻叶片的生理指标和光合作用相关指数进行测定发现，OsRhoGAP2过表达水稻剑叶的叶绿素水平和净光合速率显著高于WT，其气孔导度与蒸腾速率则极显著低于WT。说明OsRhoGAP2过表达可能通过影响水稻叶片泡状细胞的大小来改变叶片形态，进而影响水稻的光合作用。
对WT和OsRhoGAP2过表达水稻种子的萌发率检测发现，WT与3个过表达株系的种子萌发率分别为84.5%、62%、39.5%和28%，α-淀粉酶含量分别为13.82、10.82、9.85和9.66mg/g·min，且过表达水稻的种子萌发率与α-淀粉酶含量均极显著低于WT，说明OsRhoGAP2过表达通过下调α-淀粉酶活性抑制水稻种子萌发。用1000mg/LGA处理后，能在一定程度上缓解这种抑制。采用液质联用检测内源GA含量，结果显示，过表达水稻种子内源活性GA1、GA3与GA7的含量均显著低于WT。qRT-RCR结果显示，过表达水稻种子中的GA合成基因OsCPS1、OsKS1和OsKAO的相对表达量低于WT，GA灭活基因OsGA2ox6和OsGA2ox8的相对表达量高于WT，4种α-淀粉酶合成基因的相对表达量低于WT。说明OsRhoGAP2过表达降低水稻种子萌发率的原因可能与通过调控GA合成和灭活基因的表达，抑制活性GA生成，从而下调α-淀粉酶活性有关。
对成熟期WT和3个过表达株系的株高进行统计分析，发现二者的株高分别为92.12、86.5、86.4和89.22cm，且过表达水稻的株高极显著低于WT。进一步对节间及穗长进行统计发现，过表达水稻穗长与WT无明显差异，而其第一、二、三节间长度短于WT，差异极显著达水平。节间石蜡切片统计结果显示，过表达水稻的节间细胞长度小于WT，单位面积节间细胞数目多于WT，且差异均达到极显著水平。提示OsRhoGAP2过表达通过抑制节间细胞伸长，导致过表达水稻植株的矮化。
为采用功能缺失策略鉴定OsRhoGAP2基因的功能，本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了OsRhoGAP2基因编辑水稻，经筛选鉴定共获得两种纯合突变体(株系1和16)。序列比对显示，二者在靶位点分别缺失碱基“TC”和“T”，预期生成的分别是含149与60个氨基酸的截短蛋白，均没有典型的RhoGAP结构域。株系1中突变的OsRhoGAP2与WT的CRIB基序仅有3个氨基酸匹配，株系16中，突变的OsRhoGAP2对应CRIB基序部分完全缺失。水稻抽穗期的叶片与颖壳扫描电镜结果显示，株系1的表面缺乏表皮毛，而株系16与WT表型相似。剑叶光合作用指标检测显示，2种突变体的净光合速率、气孔导度均显著高于WT。说明OsRhoGAP2基因缺失提高了水稻的光合作用水平，并且株系1出现的光叶水稻表型提示，该基因的敲除可能还影响了表皮毛的发育过程。
本研究以OsRhoGAP2过表达水稻为实验材料，对OsRhoGAP2基因在植株生长发育过程中的生物功能进行鉴定，发现该基因功能涉及细胞生长、种子萌发、光合作用以及叶片形态等方面的调控，且与GA信号通路相关。另一方面，本文还构建了OsRhoGAP2基因敲除水稻，发现该基因敲除后不但影响水稻叶片的光合作用，还涉及到表皮毛的发育。这为后续探究OsRhoGAP2基因的调控网络奠定基础，也为揭示植物RhoGAP基因的功能提供新见解。