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目的hURAT1是维持血尿酸水平的关键离子通道,是导致原发性高尿酸血症的重要侯选基因。根据前期工作基础,在原发性高尿酸血症患者中发现hURAT1基因5’UTR区存在+262C／T和+292C／G点突变,未在健康人中检测到上述突变者。本研究拟进一步开展体外功能研究,探讨该点突变是否通过影响hURAT1基因启动子的活性,近而增强肾近端小管对尿酸的重吸收,导致肾脏对尿酸的排泄减少以及高尿酸血症。方法提取正常人全血基因组DNA,进行PCR扩增扩增包含hURAT1基因启动子最小功能单位和5’UTR区域在内的DNA片段,将纯化的扩增产物与表达载体PGL3-basic连接后转化DH5α感受态细胞。野生型重组质粒经KpnⅠ和BglⅡ酶切后,应用核苷酸序列测定方法进行鉴定。应用定点突变技术改变上述野生型PGL3-basic-hURAT1重组质粒5’UTR区+262C/T、+292C/G,构建突变型PGL3-basic-hURAT1重组质粒。将野生型和突变型质粒设立为八组试验组,瞬时转染OK细胞使其在细胞内表达,通过双荧光素酶报告基因系统,观察hURAT1 5’ UTR+262C/T和f292C/G点突变对hURAT1基因启动子活性的影响。结果1.野生型PGL3-basic-hURAT1重组质粒经酶切和测序显示hURAT1片段插入序列和方向正确,符合PGL3-basic载体的读码框架,证明目的基因已成功转入PGL3-basic载体中。2.突变型PGL3-basic-hURAT1重组质粒经过定点突变改变后测序鉴定,已成功进行点突变,其它序列与野生型hURAT1重组质粒的序列和方向均完全一致,并且符合PGL3-basic载体的读码框架,证明突变重组体已构建成功。3.双荧光素酶报告基因系统显示+262C/T、+292C/G分别与-424T／C连锁后与野生型重组质粒相比均可增强启动子活性。结论hURAT1基因5’UTR区+262C/T、+292C/G体外功能研究证实该两点点突变分别与-424T/C连锁后均可增强启动子活性,从而增加肾脏对尿酸盐的重吸收,引发原发性高尿酸血症。