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全世界有3.5亿乙肝病毒感染者。乙肝病毒(HBV)是导致肝硬化和肝癌的重要因素,60%～80%的肝癌患者是乙肝病人。随着对乙肝病毒治疗的深入研究,各种抗病毒药物应运而生。拉米夫定是有效抑制乙肝病毒复制的核苷类似物之一。但是,长时间用药会导致乙肝病毒出现YMDD区段发生变异,即HBV逆转录酶的保守序列YMDD中M(蛋氨酸)被V(缬氨酸)或I(异亮氨酸)所取代,变异后成为YVDD(rtM204V)或YIDD(rtM204I),导致HBV对拉米夫定产生耐药,使患者体内病毒复制反弹。本研究通过设计变异位点的选择性引物及共用探针,利用荧光定量PCR技术,建立了一种快速、有效的乙肝病毒YMDD变异率的检测方法。突变毒株在病毒群体中的百分比可以根据突变株和对照的Ct值差异进行计算。包含耐药突变的质粒经过系列稀释、混合后进行检测,以及对未经拉米夫定治疗的98例慢性乙肝患者和145例拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药突变检测,与测序方法进行对照,对结果不符的标本再进行亚克隆测序验证。并用该方法对268例经拉米夫定治疗的不同时间患者进行病毒变异率检测。对98例经拉米夫定治疗和64例经拉米夫定与干扰素a序贯治疗的e抗原阴性患者进行病毒变异率检测,验证序贯治疗的效果及其对拉米夫定变异的抑制作用。同时,对患者体内的T淋巴细胞活性及T淋巴细胞亚群情况、肝组织治疗前后病理学变化等进行了进一步分析。该方法可以在10~6～10~9拷贝/毫升HBV的血清标本中检测到0.1%的突变毒株。145例拉米夫定治疗的慢性乙肝患者中,检测到42例耐药突变株,突变比例为5～100%。6例与测序结果不符的标本突变比例为5～20%,低于测序方法的检测下限,与亚克隆测序的结果相符。98例未经拉米夫定治疗的慢性乙肝患者中有5例检测到耐药突变,变异比例为10～20%。拉米夫定治疗组的拉米夫定耐药株变异率(22.45%)显著高于序贯治疗组。实验结果表明,本研究所建立的拉米夫定耐药株变异检测方法快速灵敏,可以用于临床治疗中拉米夫定耐药变异的监测,为临床治疗方案的选择提供可靠依据。