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随着DNA遗传标记的广泛使用，除了常见的三联体、二联体亲子鉴定案件外，还会遇到祖孙和/或叔侄关系等复杂亲缘关系认定的案件，这些血缘关系的鉴定更多的出现在诸如认亲、失踪人口调查、大规模灾难事件的遗骸认定、继承、移民等事件中。近年来，此类案件有增多的趋势，而目前对此类复杂亲缘关系的判定研究尚少，更缺乏相应的判定标准。对于复杂的亲缘关系鉴定，不同的遗传标记，因具有不同的遗传特性也在不同类型的亲缘关系鉴定中发挥优势。相对于传统的毛细管电泳分型技术，运用二代测序技术，可同时获得短串联重复(short tandem repeat, STR)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)等多种类型的大量的遗传标记信息，不但可以得到包含STR基因座侧翼序列和核心重复单位的完整序列，能够鉴别长度相同的等位基因之间的序列差异，发现同等位基因(Isoallele)，而且具有高通量、低成本、快速的优点，在法医遗传学中有非常可观的应用前景。
本研究拟通过采集祖孙和/或叔侄类复杂亲缘关系家系样本，应用高通量下一代测序技术MiSeq?FGx?测序平台及ForenSeqTMDNASignaturePrepKit，同时对多种遗传标记进行检测分型。在对该方法进行实验室评估验证其准确性的基础上，分别对祖孙和/或叔侄类复杂亲缘关系样本进行检测，获得其DNA分型结果。依据遗传关系、数理统计原理和函数运算，计算累积亲权指数(cumulative paternity index, CPI)CPI和状态一致性(identity by state, IBS)等参数，比较无关个体与祖孙和/或叔侄关系CPI及IBS，推算认定与否定祖孙和/或叔侄关系CPI和IBS状态阈值，并评估阈值的风险。通过解决此类复杂亲缘关系鉴定的理论问题，为制定祖孙和/或叔侄复杂亲缘关系鉴定的标准规范提供科学依据。
第一部分复杂亲缘关系样本的采集及验证研究
目的：收集祖孙和/或叔侄亲缘关系样本，并从遗传学角度验证所采集样本之间的亲缘关系。
方法：
1样本采集：按照知情同意原则，采集河北省沧州市泊头镇王青村、吴振岗村、丰果村49个家系共计227个个体新鲜血液(5ml)样本；
2DNA提取及定量：使用E.Z.N.A.DNABloodMidikit提取血液样本基因组DNA，使用核酸定量仪进行提取样本的DNA定量；
3DNA分型：使用GoldeneyeTM20A试剂盒对上述DNA样本进行PCR扩增，包括19个STR基因座及Amelogenin性别鉴定基因座，ABI3130遗传分析仪对PCR产物进行毛细管电泳获得DNA分型；
4亲权指数计算：对每一个样本配对进行PI和FSI计算。
结果：
1DNA分型结果：227个样本均获得完整清晰的毛细管电泳分型结果，在所检样本中分别发现PentaE和D21S11两个基因座的稀有等位基因，经计算分别命名为等位基因15.2、28和30.3；
2根据计算结果，排除部分祖孙、叔侄关系，对确定全同胞关系的家系进行合并，最终确定有亲缘关系的家系29个，父母缺如的家系因遗传信息不全不能确定其亲缘关系。
小结：根据CPI及CFSI结果，结合样本采集和村民关系调查信息，确定54对祖孙关系和43对叔侄关系。
第二部分ForenSeqTMDNASignaturePrepKit人类个人识别系统的分型检测研究
目的：对MiSeq?FGx?测序平台及ForenSeqTMDNASignaturePrepKit进行实验室检测，评估该系统的准确性、与毛细管电泳技术的一致性。
方法：
1测序：使用ForenSeqTMDNASignaturePrepKit对第一部分确认亲缘关系的家系样本进行文库构建，应用MiSeq?FGx?测序平台进行测序；
2数据分析：与第一部分CE结果比对，分析两种分型方法的差异，对27个常染色体STR基因座中LB，SB，FB的分型结果和94个常染色体SNPs中SNP和SNP+进行同等位基因的统计分析；
3测序数据评估：对检测样本进行样本平均覆盖深度、基因座平均覆盖深度、基因座平均覆盖度构成比、杂合性均衡等质量评估。
结果：
1测序结果：通过两种检测分型方法，确认了第一部分发现的稀有等位基因，MiSeq?FGx?测序系统的分析软件UAS在对等位基因的命名判读较为准确，证实在实验条件控制较好的前提下，MiSeq?FGx?测序平台的测序结果稳定、准确且测序命名可靠；
2数据分析：在校正过stutter后，LB结果在分型准确性上高达99.86%，根据突变部位不同(SB和FB)，共发现16个基因座出现累计150和167个同等位基因，其中新增等位基因数目最多的等位基因为基因座D21S11等位基因30，增加了6个；新增等位基因最多的基因座是D12S391，增加了25个；
3遗传标记评价：通过实验我们发现常染色体STR中基因座D22S1045和PentaE，Y-STR基因座DYS392和DYS612，X-STR基因座DXS10103以及常染色体SNPs位点中rs1294331、rs1357617、rs4606077、rs7041158、rs2920816、rs2342724、rs1736442、rs719366和rs1031825在本实验中分型结果较差，不同程度出现杂合比差异较大、dropout、高stutter和无法检测或解读分型的问题；
4测序数据质量评估：
1)DoC:样本DoC最高达245555，最低为52741；其中STRs总覆盖深度最高为180609，最低为17897；SNPs总覆盖深度最高为71523，最低为13039；所有样本总体覆盖深度的均数和标准差为134129?45070；DYS392基因座的平均DoC离散程度最大，不稳定性最高，SNP位点rs4530059平均DoC水平在SNP中具有较高的不稳定性，但SNP整体质量较STR更高；
2)SCR:基因座DYS612和DYS481的等位基因覆盖深度最低，PentaD等位基因覆盖率最高；
3)ACR:最高的STR为D21S11基因座，为0.874，基因座D22S1045的平均杂合比最低，仅为0.41，SNPs位点rs6955448的平均杂合比最低，为0.422，最高为位点rs251934，为0.878；
小结：
1应用MiSeq?FGx?系统平台及ForenSeq?DNASignaturePrep试剂盒，对检测样本进行测序分型，通过对覆盖深度、杂合性均衡比、分型构成比等指标的分析，证实MiSeq?FGx?系统平台及ForenSeq?DNASignaturePrep试剂盒在我室具有较好的分型表现和可靠稳定的质量保证；
2应用MiSeq?FGx?系统平台可得到较多基因座的同等位基因和等位基因突变结果，同等位基因的出现为等位基因分型的解读提供了更多的差异信息，可为进行法医学个人识别和亲权鉴定提供更高的个人识别能力。
第三部分祖孙和/或叔侄关系的理论鉴定阈值及风险评估研究
目的：推算祖孙关系和/或叔侄关系的判定阈值，对阈值进行验证评估。
方法：
1基础数据计算：将111个样本进行祖孙和/或叔侄关系和无关个体对两组，分别进行CPI、IBS的计算；
2阈值确定：使用数理理论和统计软件，分别应用基于经典ITO法和判别分析法进行判定阈值的计算；
3阈值评价：使用SPSS21.0软件对上述统计的基础数据进行正态分布、t-检验、Fisher检验和LOOCV，使用主要评价指标分别进行验证。
结果与小结：
1基于ITO法计算CPI值，设置CLR＞1和CLR＜0.1作为121个LB-SNP基因座的系统认定和排除祖孙和/或叔侄关系的阈值，且在此情况下，其判定准确度高于95%；
2基于判别分析法法计算IBS值，经校正计算后，认定阈值表述为IBS-7.5A0>35.5，排除阈值为IBS-7.5A0＜-4，该情况下在FB+SNP系统中存在最大准确度，且准确度为86.1%。
结论：
1对MiSeq?FGx?测序平台及ForenSeq?SignaturePrep试剂盒的评估表明，该检测系统在本实验室展现良好的稳定性和一致性；较传统的CE技术能够同时获得更多基因座分型结果，并能检测到STR基因座更多的同等位基因，大大提高个体识别及亲缘关系鉴定的系统效能；
2基于ITO法计算CPI值，设置CLR＞1和CLR＜0.1作为121个LB-SNP基因座的系统认定和排除祖孙和/或叔侄关系的阈值，且在此情况下，其判定准确度高于95%；基于判别分析法法计算IBS值，经校正计算后，认定阈值表述为IBS-7.5A0＞35.5，排除阈值为IBS-7.5A0＜-4，该情况下在FB+SNP系统中存在最大准确度，且准确度为86.1%；
3使用MiSeq?FGx?测序平台及ForenSeq?SignaturePrep试剂盒对河北汉族人群的祖孙和/或叔侄关系进行的检测结果提示，NGS可以为解决复杂亲缘关系案件提供一个遗传信息全面、准确度较高的新思路。
本研究拟通过采集祖孙和/或叔侄类复杂亲缘关系家系样本，应用高通量下一代测序技术MiSeq?FGx?测序平台及ForenSeqTMDNASignaturePrepKit，同时对多种遗传标记进行检测分型。在对该方法进行实验室评估验证其准确性的基础上，分别对祖孙和/或叔侄类复杂亲缘关系样本进行检测，获得其DNA分型结果。依据遗传关系、数理统计原理和函数运算，计算累积亲权指数(cumulative paternity index, CPI)CPI和状态一致性(identity by state, IBS)等参数，比较无关个体与祖孙和/或叔侄关系CPI及IBS，推算认定与否定祖孙和/或叔侄关系CPI和IBS状态阈值，并评估阈值的风险。通过解决此类复杂亲缘关系鉴定的理论问题，为制定祖孙和/或叔侄复杂亲缘关系鉴定的标准规范提供科学依据。
第一部分复杂亲缘关系样本的采集及验证研究
目的：收集祖孙和/或叔侄亲缘关系样本，并从遗传学角度验证所采集样本之间的亲缘关系。
方法：
1样本采集：按照知情同意原则，采集河北省沧州市泊头镇王青村、吴振岗村、丰果村49个家系共计227个个体新鲜血液(5ml)样本；
2DNA提取及定量：使用E.Z.N.A.DNABloodMidikit提取血液样本基因组DNA，使用核酸定量仪进行提取样本的DNA定量；
3DNA分型：使用GoldeneyeTM20A试剂盒对上述DNA样本进行PCR扩增，包括19个STR基因座及Amelogenin性别鉴定基因座，ABI3130遗传分析仪对PCR产物进行毛细管电泳获得DNA分型；
4亲权指数计算：对每一个样本配对进行PI和FSI计算。
结果：
1DNA分型结果：227个样本均获得完整清晰的毛细管电泳分型结果，在所检样本中分别发现PentaE和D21S11两个基因座的稀有等位基因，经计算分别命名为等位基因15.2、28和30.3；
2根据计算结果，排除部分祖孙、叔侄关系，对确定全同胞关系的家系进行合并，最终确定有亲缘关系的家系29个，父母缺如的家系因遗传信息不全不能确定其亲缘关系。
小结：根据CPI及CFSI结果，结合样本采集和村民关系调查信息，确定54对祖孙关系和43对叔侄关系。
第二部分ForenSeqTMDNASignaturePrepKit人类个人识别系统的分型检测研究
目的：对MiSeq?FGx?测序平台及ForenSeqTMDNASignaturePrepKit进行实验室检测，评估该系统的准确性、与毛细管电泳技术的一致性。
方法：
1测序：使用ForenSeqTMDNASignaturePrepKit对第一部分确认亲缘关系的家系样本进行文库构建，应用MiSeq?FGx?测序平台进行测序；
2数据分析：与第一部分CE结果比对，分析两种分型方法的差异，对27个常染色体STR基因座中LB，SB，FB的分型结果和94个常染色体SNPs中SNP和SNP+进行同等位基因的统计分析；
3测序数据评估：对检测样本进行样本平均覆盖深度、基因座平均覆盖深度、基因座平均覆盖度构成比、杂合性均衡等质量评估。
结果：
1测序结果：通过两种检测分型方法，确认了第一部分发现的稀有等位基因，MiSeq?FGx?测序系统的分析软件UAS在对等位基因的命名判读较为准确，证实在实验条件控制较好的前提下，MiSeq?FGx?测序平台的测序结果稳定、准确且测序命名可靠；
2数据分析：在校正过stutter后，LB结果在分型准确性上高达99.86%，根据突变部位不同(SB和FB)，共发现16个基因座出现累计150和167个同等位基因，其中新增等位基因数目最多的等位基因为基因座D21S11等位基因30，增加了6个；新增等位基因最多的基因座是D12S391，增加了25个；
3遗传标记评价：通过实验我们发现常染色体STR中基因座D22S1045和PentaE，Y-STR基因座DYS392和DYS612，X-STR基因座DXS10103以及常染色体SNPs位点中rs1294331、rs1357617、rs4606077、rs7041158、rs2920816、rs2342724、rs1736442、rs719366和rs1031825在本实验中分型结果较差，不同程度出现杂合比差异较大、dropout、高stutter和无法检测或解读分型的问题；
4测序数据质量评估：
1)DoC:样本DoC最高达245555，最低为52741；其中STRs总覆盖深度最高为180609，最低为17897；SNPs总覆盖深度最高为71523，最低为13039；所有样本总体覆盖深度的均数和标准差为134129?45070；DYS392基因座的平均DoC离散程度最大，不稳定性最高，SNP位点rs4530059平均DoC水平在SNP中具有较高的不稳定性，但SNP整体质量较STR更高；
2)SCR:基因座DYS612和DYS481的等位基因覆盖深度最低，PentaD等位基因覆盖率最高；
3)ACR:最高的STR为D21S11基因座，为0.874，基因座D22S1045的平均杂合比最低，仅为0.41，SNPs位点rs6955448的平均杂合比最低，为0.422，最高为位点rs251934，为0.878；
小结：
1应用MiSeq?FGx?系统平台及ForenSeq?DNASignaturePrep试剂盒，对检测样本进行测序分型，通过对覆盖深度、杂合性均衡比、分型构成比等指标的分析，证实MiSeq?FGx?系统平台及ForenSeq?DNASignaturePrep试剂盒在我室具有较好的分型表现和可靠稳定的质量保证；
2应用MiSeq?FGx?系统平台可得到较多基因座的同等位基因和等位基因突变结果，同等位基因的出现为等位基因分型的解读提供了更多的差异信息，可为进行法医学个人识别和亲权鉴定提供更高的个人识别能力。
第三部分祖孙和/或叔侄关系的理论鉴定阈值及风险评估研究
目的：推算祖孙关系和/或叔侄关系的判定阈值，对阈值进行验证评估。
方法：
1基础数据计算：将111个样本进行祖孙和/或叔侄关系和无关个体对两组，分别进行CPI、IBS的计算；
2阈值确定：使用数理理论和统计软件，分别应用基于经典ITO法和判别分析法进行判定阈值的计算；
3阈值评价：使用SPSS21.0软件对上述统计的基础数据进行正态分布、t-检验、Fisher检验和LOOCV，使用主要评价指标分别进行验证。
结果与小结：
1基于ITO法计算CPI值，设置CLR＞1和CLR＜0.1作为121个LB-SNP基因座的系统认定和排除祖孙和/或叔侄关系的阈值，且在此情况下，其判定准确度高于95%；
2基于判别分析法法计算IBS值，经校正计算后，认定阈值表述为IBS-7.5A0>35.5，排除阈值为IBS-7.5A0＜-4，该情况下在FB+SNP系统中存在最大准确度，且准确度为86.1%。
结论：
1对MiSeq?FGx?测序平台及ForenSeq?SignaturePrep试剂盒的评估表明，该检测系统在本实验室展现良好的稳定性和一致性；较传统的CE技术能够同时获得更多基因座分型结果，并能检测到STR基因座更多的同等位基因，大大提高个体识别及亲缘关系鉴定的系统效能；
2基于ITO法计算CPI值，设置CLR＞1和CLR＜0.1作为121个LB-SNP基因座的系统认定和排除祖孙和/或叔侄关系的阈值，且在此情况下，其判定准确度高于95%；基于判别分析法法计算IBS值，经校正计算后，认定阈值表述为IBS-7.5A0＞35.5，排除阈值为IBS-7.5A0＜-4，该情况下在FB+SNP系统中存在最大准确度，且准确度为86.1%；
3使用MiSeq?FGx?测序平台及ForenSeq?SignaturePrep试剂盒对河北汉族人群的祖孙和/或叔侄关系进行的检测结果提示，NGS可以为解决复杂亲缘关系案件提供一个遗传信息全面、准确度较高的新思路。