乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种闭合环状DNA，能够引起以淋巴单核细胞浸润和枯否细胞过度增生为主要特征的急慢性肝炎。具有免疫功能的成年人的HBV感染常常导致自限性的、短暂的肝损伤和病毒清除。只有很少比例的感染者(5％～10％)形成与病毒持续感染相关的慢性肝炎。然而，当新生儿感染时，超过90％的感染者将转成持续感染者，并形成不同程度的肝脏损伤。 DNA免疫是指将含有编码某种特异抗原的外源基因及其必要表达调控元件的真核表达质粒直接导入机体内，以诱导机体表达编码序列的蛋白，并经体内抗原呈递细胞(APC)处理，刺激机体免疫系统产生保护性免疫应答，包括特异性CTL应答及特异抗体的产生等等。因此DNA疫苗被认为是一种极具发展潜力的第三代疫苗，在许多疾病的治疗和预防方面显示出广泛的应用前景。 HBV形成慢性感染的主要机制在于感染者不能产生强有力的细胞免疫应答以清除病毒。慢性HBV感染者体内虽然存在HBV抗原特异性T淋巴细胞，但对HBV抗原的反应性较低。与亚单位重组疫苗相比，DNA介导的免疫反应更能有效地激发机体对乙型肝炎表面抗原的免疫反应，有效诱导细胞免疫应答；HBV表面抗原DNA疫苗接种HBV转基因小鼠还能抑制HBV基因的表达，表明DNA疫苗对于慢性HBV感染有潜在的治疗作用。 虽然DNA免疫可以有效地引起机体对HBV的免疫反应，在体内长期存在是否引起副作用目前还知之甚少；因此安全性问题一直是DNA疫苗不能应用于临床的一大障碍。有研究者在长达2个月的时间内连续检测到HBsAg蛋白的存在，表明HBsAg基因在注射部位的肌肉组织中可以长时期持续性表达。为深入探讨应用DNA免疫防治乙肝病毒感染的可能性以及由DNA免疫可能产生的副作用及其病理基础，本研究以乙肝病毒preS2-S基因为抗原基因，构建DNA真核表达载体，并 粼州犬李麟广李企忿见‘HB厂双幼l兔痊以起多器宫{肺几理芡涝泌典次凌功夕头珊研夕艺功戈抑要 采用肌肉注射的方法将该质粒注射入正常BALB/’c刁、鼠体内，观察其在小鼠体内诱 导的免疫应答、在小鼠不同脏器中的分布及可能对脏器造成的损伤，以期为研究 能有效应用于人类的了武召VD入只疫苗提供可靠的实验依据和理论基础。 转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的一项生物技术。随着转基 因技术的不断改进，至今已研制出百余种人类疾病转基因动物模型，并被广泛用 于生物医学各领域，尤其在传染病、遗传病和肿瘤等方面。但是，万召醉只有很强 的种属特异性和组织特异性，只能感染人和少数高等灵长类动物(如大猩猩等) 的肝细胞，同时由于月公州专播的体外系统一直没有建立，因而对它的研究在一定程度上受到限制。1 985年产生了第l个携带万召F的转基因小鼠动物模型，随后一系列小鼠产绍于模型很快建立起来，为研究宿主对产了召F各个抗原的免疫应答、检查宿主因素对病毒复制和发病机制的影响、探索产扭不傲肝细胞癌变机制及药物筛选等提供了新的有效手段，成为目前研究乙肝较为理想的动物模型。本研究在对万召犷病毒在转基因小鼠中的表达特征进行分析的基础上，注射抗血清以期探讨该转基因小鼠在慢性乙型肝炎发病机制及治疗中的应用前景。 本实验利用尸cR及基因重组技术，构建了月万.叼9 presZ一S表达载体，应用D入月免疫有效地诱导小鼠体液免疫应答，探讨了影响D入叼免疫产生有效免疫应答的影响因素:同时对D瓦咬免疫引起免疫小鼠多器官损伤及其可能的损伤机制进行了研究。 主要方法和结果如下:1.pcD八“‘2~s的扩增、表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达 用含有HBv/adrD入只双拷贝的pBR刃2质粒为模板，尸cR反应扩增HBvsZ一s基因片段，将扩增的片段定向插入表达载体pcD入月了.0的Hindll拜口EcoRI的酶切位点中;该片段位于人巨细胞病毒(C几了F夕启动子下游，可表达万召V中(M)蛋白和小(S)蛋白;重组体转化大肠杆菌DHS。菌株，限制性酶切鉴定并筛选重组体，将筛选到的阳性克隆测序分析，结果显示扩增的片段全长895bP，编码295个氨基酸，蛋白分子量约33KD，内部不含终止码。将此重组质粒命名为PcD八月S2一S。电穿孔法将重组质粒分别转染入Hela和7721细胞株进行表达，可见该表达载体能高效的表达于2种细胞株。2.pcD八河5?召诱导BALB/c小鼠产生体液免疫应答产粼洲才学膊全学应‘落戈HB犷刀戊咬一免雳引起多器宫{厉;望费费资真次脚尉实珊研芜创沪灵满要. 用建立的pcD入月s2一s表达载体注射BALB/c小鼠胫骨前肌，运用ELL又咬检测不同时间小鼠血清中抗.月召，。结果显示:接种疫苗1周后血清中即可测得抗一HBs，并在4周后达到高峰，可持续至少3个月以上，表明本研究所构建的presZ一s表达载体能有效的诱导BALB/c小鼠产生体液免疫应答。3.影响pcD入对S2召表达载体诱导免疫应答的因素 应用能够在哺乳动物细胞中有效表达的不同阳性克隆以相同的D八只浓度在相同的时间免疫不同品系的小鼠，结果发现:①以相同的质粒刀入月同时免疫BAL丑/c小鼠和心左址形小鼠，尽管2种品系小鼠均产生了免疫应答，但所产生免疫应答的强弱明显不同，在相同的时?