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[目的]采用冻融-冻干法探索聚乙二醇3000(PEG3000)修饰的脂质体作为流感疫苗佐剂和聚乙二醇6000(PEG6000)修饰的脂质体作为流感疫苗佐剂的最佳制备工艺、理化性质、免疫原性和稳定性。[方法]采用冻融-冻干法制备PEG3000修饰流感疫苗脂质体冻干粉和PEG6000修饰流感疫苗脂质体冻干粉,采用MTT法以刺激指数作为主要评价指标,通过单因素方差分析确定最佳处方。最佳处方制备的目标产品,通过腹腔免疫小鼠7、14和28天后,采用MTT法和表面标记法以刺激指数(SI)和CD4+/CD8+、CD3+CD8+、CD3+CD4+、CD3+为评价指标进行细胞免疫原性研究,采用微量血凝抑制法和表面标记法以抗体滴度比和CD3-CD45R+为评价指标进行体液免疫原性研究。采用碳廓清法和表面标记法以吞噬指数和CD3-CD49b+为评价指标进行非特异免疫原性研究。将通过以上最优工艺制得PEG3000修饰的脂质体冻干粉、PEG3000修饰的脂质体混悬液、PEG6000修饰的脂质体冻干粉、PEG6000修饰的脂质体混悬液置于4℃、25±2℃和37±2℃条件下进行稳定性试验,以包封率为指标考察其物理学稳定性,以抗体滴度比和脏器指数为指标考察其生物学稳定性。[结果]PEG3000和PEG6000占卵磷脂的百分摩尔比为4%时,脂质体成膜后加入PEG3000和PEG6000制备的流感疫苗脂质体冻干粉为最佳处方。用最佳处方制备的PEG3000(或PEG6000)修饰脂质体冻干粉、无修饰中性脂质体冻干粉、非脂质体疫苗原液和PBS阴性对照组腹腔注射免疫小鼠,在免疫一个免疫周期里,其中细胞免疫原性的脾脏T淋巴细胞中PEG3000修饰脂质体冻干粉组中的SI值、CD4+/CD 8+、CD3+CD4+、CD3+与其他各组有显著性差异(P<0.05）,且高于无修饰中性脂质体组,说明PEG3000修饰流感疫苗脂质体增强细胞免疫原性;PEG3000修饰脂质体组的CD3+CD8+与其他组间无显著性差异,说明PEG3000修饰流感疫苗脂质体不刺激细胞毒性的T细胞亚群增加;PEG6000修饰脂质体冻干粉组中的Sl值、CD4+/CD8+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+与其他各组有显著性差异(P<0.05）,且高于无修饰中性脂质体组,说明PEG6000修饰流感疫苗脂质体增强细胞免疫原性。胸腺T淋巴细胞中PEG3000和PEG6000修饰脂质体冻干粉组中的CD3+CD4+与其他各组有显著性差异(P<0.05）,且高于无修饰中性脂质体组,说明PEG3000和PEG6000修饰流感疫苗脂质体刺激T辅助细胞亚群增加;PEG3000和PEG6000修饰脂质体组的CD3+CD8+、CD3+与其他组间无显著性差异,说明PEG3000和PEG6000修饰流感疫苗脂质体不刺激T细胞亚群增加。体液免疫原性中PEG3000和PEG6000修饰脂质体的冻干粉组中始终HI≥4且优于其他组,PEG3000和PEG6000修饰流感疫苗脂质体的CD3-CD45R+与其他组间有显著性差异(P<0.01）,且高于无修饰中性脂质体组,说明PEG3000和PEG6000修饰流感疫苗脂质体增强体液免疫原性;非特异性免疫免疫原性中PEG3000和PEG6000修饰脂质体组的PI值与PBS阴性对照无显著性差异,说明PEG3000和PEG6000修饰流感疫苗脂质体不易被巨噬细胞吞噬;CD3-CD49b+与其他组间有显著性差异(P<0.05）,且高于无修饰中性脂质体组,说明PEG3000和PEG6000修饰流感疫苗脂质体刺激NK细胞亚群增加。用最佳处方制备的PEG3000和PEG6000修饰脂质体冻干粉、无修饰中性脂质体冻干粉、非脂质体疫苗原液和PBS阴性对照组腹腔注射免疫小鼠后,在免疫一个免疫周期里,在细胞免疫中PEG6000修饰的流感疫苗脂质体组的Sl值与其他组有显著性差异(P<0.05）,且优于PEG3000修饰的流感疫苗脂质体组,说明随着分子量的增加细胞免疫原性增强;体液免疫原性中PEG6000修饰的流感疫苗脂质体组与PEG3000修饰的流感疫苗脂质体组没有显著性差异;非特异免疫原性中PEG6000修饰的流感疫苗脂质体组与PEG3000修饰的流感疫苗脂质体组没有显著性差异。PEG3000修饰的流感疫苗脂质体冻干粉和PEG6000修饰的流感疫苗脂质冻干粉体物理稳定性的考察,在4℃、25±2℃和37±2℃贮存条件下时,PEG3000修饰的流感疫苗脂质体冻干粉和PEG6000修饰的流感疫苗脂质体冻干粉在贮存6 month内的包封率下降相对于其混悬液低,且4℃贮存条件下的包封率高于25±2℃和37±2℃贮存条件下,表明PEG3000修饰的流感疫苗脂质体冻干粉和PEG6000修饰的流感疫苗脂质体冻干粉的物理学稳定性较好。PEG3000修饰的流感疫苗脂质体冻干粉和PEG6000修饰的流感疫苗脂质体冻干粉生物学稳定性的考察中,在4℃贮存条件下时,PEG3000修饰的流感疫苗脂质体和PEG6000修饰的流感疫苗脂质体在贮存3 month内的HI≥4;25±2℃贮存条件下时,PEG3000修饰的流感疫苗脂质体和PEG6000修饰的流感疫苗脂质体在贮存3 month内的HI≥4,且4℃贮存条件下的抗体滴度比高于25±2℃贮存条件下的,表明PEG3000修饰的流感疫苗脂质体冻干粉和PEG6000修饰的流感疫苗脂质体冻干粉的生物学稳定性良好,且4℃为最佳存贮条件。[结论]PEG3000和PEG6000占卵磷脂的百分摩尔比为4%时,脂质体成膜后加入PEG3000和PEG6000制备的流感疫苗脂质体冻干粉为最佳处方。上述两种目标产品能产生较好免疫原性;PEG6000修饰的流感疫苗脂质体的细胞免疫原性优于PEG3000修饰的流感疫苗脂质体;体液免疫原性和非特异免疫原性中,PEG3000和PEG6000修饰的流感疫苗脂质体没有显著性差异,说明其具有体液免疫原性但不易被巨噬细胞吞噬,延长血液中的滞留时间。且PEG6000修饰的流感疫苗脂质体冻干粉和PEG3000修饰的流感疫苗脂质冻干粉具有较好的稳定性。