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研究背景:
细胞代谢和外源性因素引起的细胞氧化/抗氧化平衡紊乱,损害脂质、蛋白质、核酸功能,从而导致氧化应激,见于多种疾病中[1]。在细胞模型中,高温、氧化剂处理可导致氧化应激,与多种信号转导通路的激活机制有关[2,3]。另一方面,一定程度的氧化应激,可增强细胞、机体适应能力,并与某些应激保护性蛋白的合成有关[4,5]。在众多氧化应激研究中对损伤机制已有较深入的研究,而对氧化应激适应的机制研究不够,而这两个环节是环境因素伤害作用与机体抵御氧化应激伤害应答中的关键环节。氧化应激适应的生物学机制的探索,将有助于能阐明机体对应激适应的分子机制,为探讨相关疾病的机理、疾病治疗、疾病预防和新药开发提供重要的理论基础。
氧化应激状态下机体蛋白质表达谱研究的深入[6]为进一步探讨氧化应激与适应的分子机制奠定了基础。SWISS-PORT蛋白质数据库中可检索到220种与人类应激相关的蛋白质。热休克蛋白90(heatshockprotein,Hsp90)是公认的与应激适应密切相关的保护性分子,可在共作用伴侣蛋白(co-chaperones)的协助下,调节底物蛋白折叠、聚合来保护其生物功能;作为Hsp90底物蛋白的细胞骨架蛋白参与细胞内多种信号转导网络并是维持细胞正常生理功能的关键分子,是氧化应激损伤的早期靶目标[7]。并有研究表明,Hsp90可稳定骨架蛋白的聚合[8],因此,探讨两者在氧化应激预适应中的共作用关系有助于阐明热休克蛋白90作为应激保护性分子的作用机制。
目的:
1.通过氧化应激和预适应建立HepG2细胞Hsp90的差异表达模型[9];
2.研究在氧化应激和预适应条件下,HepG2细胞活性和细胞内Hsp90和骨架蛋白Tubulin、Vimentin的表达情况的关系;
3.分析骨架蛋白Tubulin、Vimentin和Hsp90在正常环境(对照组)、应激、预适应等不同状态下的分布和量的变化趋势,并以此进一步探讨热休克蛋白在氧化应激预适应下对细胞保护作用的分子机制。
方法:
1.建立预适应及氧化应激HepG2细胞模型:将细胞分为对照组(C)、氧化应激组(O)、预适应组(P)和预适应后氧化应激组(P+O)。预适应因素:50μmol/L,H2O2,2h,普通培养基孵育10h,氧化应激因素:500μmol/L,H2O2,24h。通过MTT比色法和Hoechst33342染色法测定和观察不同条件下的细胞存活情况。
2.以Western-blot检测不同条件下胞内Hsp90及骨架蛋白Tubulin和Vimentin的差异表达情况。
3.应用免疫荧光方法检测不同情况下Hsp90及骨架蛋白Tubulin和Vimentin的分布情况。
结果:
1.MTT比色法测定细胞生存活力:氧化应激明显降低细胞生存活力(Ov.s.C;P+Ov.s.P,P<0.05)。预适应可提高氧化应激后的细胞生存活力(P+Ov.s.O,P<0.05)。
2.Heochst33342染色法观察细胞凋亡结果:氧化应激导致凋亡细胞明显增多;预适应可明显减少氧化应激后凋亡细胞数。
3.预适应和氧化应激对Hsp90和Tubulin、Vimentin的表达量的影响:氧化应激导致胞内Hsp90、Tubulin和Vimentin表达量明显降低(Ov.s.C,P<0.05)。预适应可提高胞内Hsp90、Tubulin和Vimentin表达量(Pv.s.C,P<0.05),并在氧化应激后维持较高水平(P+Ov.s.O,P<0.05)。
4.Hsp90和Tubulin、Vimentin有相似的细胞内分布:不同条件下,体外培养的HepG2细胞中Hsp90的分布与细胞骨架蛋白Tubulin和Vimentin一致。①对照组显示了正常生理情况下Hsp90和Tubulin及Vimentin在细胞内趋势一致,均匀分布于胞浆和胞核;②而直接应激组中两种蛋白在胞浆中呈现一致的散在点状分布,更多聚集于胞核周围,且总体密度小于对照组;③预适应组两种蛋白分布,光密度较对照组显著增加,主要分布于胞浆;④预适应后应激组的光密度与预适应组相比在应激后则轻微减弱,总的光密度和分布范围略大于直接应激组。
结论:
1.预适应可增加细胞内Hsp90的表达水平并改变其胞内分布,从而减轻应激引起的细胞形态和功能改变,实现再次应激时的保护作用;
2.骨架蛋白Tubulin和Vimentin与应激保护性分子Hsp90在正常环境(对照组)、应激、预适应等不同条件下的表达水平差异和分布的变化具有相同的趋势,从而推测Hsp90可能通过协同信号转导通路平台--骨架蛋白网络与各种氧化应激信号分子结合,在氧化应激中起保护作用。