近年来，人工关节无菌松动的预防方法研究倍受关注。本研 究课题探讨药物预防人工关节术后无菌松动的实验依据。 目 的 一、研制假体──骨界面模型，模拟人工关节置换术后假体周围骨 组织的病理变化。应用此模型探讨ALEN对假体骨长入的 影响。 二、建立体外破骨细胞分离培养方法，体外观察ALEN对破骨 细胞的作用。 三、建立人成骨细胞体外培养方法，体外观察ALEN对成骨细 胞增殖的影响。 材料和方法 一、对集骨器进行改良，研制骨长入界面模型假体（IC）：将 IC植入新西兰兔双侧胫骨干骺端，建立骨长入界面模型。20只 兔分为两组，自体对照，左侧胫骨为实验组，每只动物于植入IC 后第2、8、15天，将浓度为10~－７M阿伦磷酸钠100μl经皮注入 假体-骨长入界面；右侧做为对照组，在相同的时间给予等量生 理盐水。术后4周，假体周围骨组织取材，10只动物标本进行 H.E染色，组织学观察，并用骨组织图像分析系统对两组的成骨 情况进行比较。另10只动物标本做生物力学打出实验，观察ALEN 对假体──骨组织结合力的影响。 二、建立破骨细胞体外培养系统：新生24小时以内的Wistar 大鼠拉颈处死，皮肤以75％酒精灭菌。取四肢长骨骨髓种于4× 4mm~2×100μm骨磨片和盖玻片上，24小时后，取骨片和盖玻片 －2－ t 解放军军医进修学院 博士论文 进行Giemsa、抗酒石酸酸性磷酸酶和甲苯胺蓝染色。采用破骨 细胞连续拍片、图像分析等方法观察不同浓度的ALEN对破骨 细胞形态、数量的影响；采用丫啶橙方法观察ALEN对破骨细 胞凋亡的影响。 三、建立人成骨细胞培养方法：手术中获取病人的髂骨块， 去除肌肉、骨膜，DMEM培养液冲洗松质骨。松质骨块修剪成 1-2mm~3大小，消化液（０.4％胶原酶和 0.5％胰蛋白酶 DMEM培 养液个一半体积）中消化1小时，吸取细胞悬液种于培养瓶中。 成骨细胞传四代，进行碱性磷酸酶染色，并接种于2块96孔板 中。培养24小时后，更换不同浓度的ALEN，2块培养板分别 继续培养48、72小时，MTh方法检测ALEN对成骨细胞增殖的 影响。 结 果 一、IC模型假体植人兔双侧腔骨近端无不良反应，4周后假 体与周围皮质骨整合，皮质骨通过外筒小孔长入与内筒壁形成骨 长入界面，随时间增加，小孔中长入的骨组织增加。与对照组相 比，10”’M ALEN治疗组成骨率明显增加0＜0．of入 假体最大打 出力增大o叼刀1入 二、体外培养的破骨细胞含有多个细胞核，具有破骨细胞的 形态特点，破骨细胞特异的抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性，与骨 磨片共同培养可以形成被甲苯胺蓝染成兰色的骨吸收窝。大于等 于 10－’OM浓度的 ALEN明显降低破骨细胞的活动度和展平面积 0功刀1人－而10“’＊浓度的AL EN对破骨细胞的展平面积无影 响0＞0刀5人ALEN临床治疗骨质疏松的剂量作用下，盖玻片 上破骨细胞的数量明显减少o功．01人 平均骨吸收窝的面积降 低①叼．01人 丫陡橙能特异地与细胞染色质结合，在592urn波 长的激发光下发出黄色荧光来显示细胞核的形态。ALEN作用 －3－ t 博士论文 解放军军医进修学院 下，呈现凋亡形态的细胞明显增多，即细胞核固缩、碎裂、荧光 加深。在实验浓度范围内，ALEN的浓度越高，凋亡的破骨细胞 越多（P＜O．01）。 三、以人的髓骨松质骨为材料培养所得的成骨细胞具有典型 的形态特点，成骨细胞特异性染色－碱性磷酸酶染色阳性。传4 代培养的成骨细胞 MTh方法检测结果显示：高于 10－’M浓度的 ALEN明显抑制成骨细胞的增殖；ALEN的浓度低于 10“M时， 成骨细胞的增殖不受影响。 ＠＆ 一、IC模型假体植入手术简单，而且可以根据需要将研究因 素在不破坏假体－骨整合的情况下加到骨长入界面。本研究认为， 在 10”’OM～10“M浓度之间，ALEN抑制破骨细胞的功能，相对 增加成骨，增加骨长人，加强假体骨整合。 二、本课题建立的破骨细胞培养方法可以获得具有功能?