论文部分内容阅读
目的:单次气道注入高表达IL-1β的腺病毒建立慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）气道重塑模型,同时分离培养气道重塑小鼠原代支气管成纤维细胞（Mice Bronchial Fibroblasts,MBFs）,探讨IL-17A是否通过干预COPD原代MBFs自噬影响胶原蛋白、CCL20等炎性细胞因子的产生,从而参与气道炎症及气道重塑。方法:1、选取6-8周龄C57BL/6J小鼠20只,适应性喂养1周后随机分为2组,Ad-Lac Z组和Ad-IL-1β组,单次气道注入高表达IL-1β的腺病毒建立COPD气道重塑模型。小鼠肺功能、HE染色、Masson染色判断COPD气道重塑模型是否成功建立。ELISA检测小鼠肺组织中IL-17A、CCL20等炎性细胞因子的表达。WB检测小鼠肺组织中自噬相关蛋白LC3II/LC3I、Beclin-1、P62和PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白以及Collagen I、Collagen III的表达。2、酶联合消化法+组织块贴壁法培养COPD原代MBFs,免疫荧光鉴定COPD MBFs标记物波形蛋白。CCK-8摸索IL-17A、雷帕霉素干预MBFs的最佳浓度和时间后将实验分为4组:对照组、雷帕霉素组（Rapa）、IL-17A组、IL-17A+雷帕霉素组（IL-17A+Rapa）。WB检测四组COPD MBFs中自噬相关蛋白LC3II/LC3I、Beclin-1、P62及Collagen I、Collagen III的表达,ELISA检测细胞上清液中炎性细胞因子CCL20、IL-10、IL-6的表达。结果:1、COPD气道重塑模型:小鼠肺功能结果显示与Ad-Lac Z组相比,Ad-IL-1β组FEV0.1/FVC、动态肺顺应性（Cdyn）降低（P＜0.05）。肺组织HE、Masson染色结果显示,与Ad-Lac Z组相比,Ad-IL-1β组小气道附近见大量炎性细胞聚集、气道壁增厚以及胶原纤维增加。2、肺组织中炎性细胞因子的表达:ELISA结果显示,与Ad-Lac Z组相比,Ad-IL-1β组IL-17A、CCL20、IL-6表达增加（P＜0.05）,IL-10表达减少（P＜0.05）。3、肺组织中自噬相关蛋白和PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白的表达:WB结果显示,与Ad-Lac Z组相比,Ad-IL-1β组LC3II/LC3I、Beclin-1降低（P＜0.05）,P62增加（P＜0.05）;Ad-IL-1β组p-PI3K/total PI3K、p-AKT/total AKT、p-m TOR/total m TOR比值增加（P＜0.05）。4、肺组织中Collagen I和Collagen III的表达:WB结果显示,与Ad-Lac Z组相比,Ad-IL-1β组Collagen I和Collagen III增加（P＜0.01）。5、COPD原代MBFs的培养与鉴定:酶联合消化法+组织块贴壁法分离培养COPD MBFs,MBFs呈长梭形、多角形,免疫荧光鉴定MBFs表面标记物波形蛋白为强阳性,CCK-8测MBFs生长曲线近似“S型”。6、Rapa及IL-17A的干预浓度和干预时间:CCK-8结果显示,Rapa和IL-17A干预MBFs最佳浓度分别为2μmol/L、10 ng/m L,最佳干预时间均为24小时。7、IL-17A抑制MBFs自噬:WB结果显示,与Control组MBFs相比,IL-17A组MBFs中LC3II/LC3I和Beclin-1表达减少（P＜0.05）,P62表达增加（P＜0.05）;Rapa组MBFs中LC3II/LC3I表达增加（P＜0.05）,Beclin-1表达无统计学意义,P62表达减少（P＜0.05）。与Rapa组MBFs相比,IL-17A+Rapa组MBFs中LC3II/LC3I、Beclin-1表达减少（P＜0.05）,P62表达增加（P＜0.05）。8、IL-17A抑制MBFs自噬后促进Collagen I和Collagen III表达:WB结果显示,与Control组MBFs相比,IL-17A组MBFs中Collagen I和Collagen III增加（P＜0.01）;Rapa组MBFs中Collagen I和Collagen III表达减少（P＜0.01）。与Rapa组MBFs相比,IL-17A+Rapa组MBFs中Collagen I和Collagen III增加（P＜0.01）。9、IL-17A抑制MBFs自噬后对炎性细胞因子的影响:ELISA结果显示,与Control组MBFs相比,IL-17A组MBFs CCL20增加（P＜0.01）,IL-10减少（P＜0.01）;Rapa组MBFs分泌的CCL20无统计学差异,IL-10减少（P＜0.01）。与Rapa组MBFs相比,IL-17A+Rapa组MBFs CCL20增加（P＜0.01）,IL-10减少（P＜0.01）。4组MBFs中IL-6的表达均无统计学意义。结论:1、COPD小鼠肺组织中IL-17A、CCL20增加。2、COPD小鼠肺组织中自噬水平降低,PI3K/AKT/m TOR信号通路活化可能是自噬降低的机制。3、COPD小鼠肺组织中Collagen I和Collagen III增加。4、IL-17A抑制COPD原代MBFs自噬。5、IL-17A通过调控COPD原代MBFs自噬促进Collagen I和Collagen III表达。6、IL-17A促进COPD原代MBFs分泌CCL20,减少IL-10的分泌。