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目的心血管疾病的死亡率和发病率逐年上升,到目前为止已成为全球最常见的死亡病因之一,对于其发病原因的探究也成为临床研究的重大命题。心肌肥大属于心血管疾病的典型病理表现,长期的病理性肥大最终会导致心肌收缩失调和心力衰竭,这也就大大增加了心血管疾病的发病率和病死率。心肌肥大的病理性表现之一就是心肌细胞肥大,其主要内在机制是细胞中蛋白质的合成增加以及降解减少。然而,UPS(Ubiquitin proteasome system)即泛素蛋白酶体系统在调控蛋白质的代谢这一方面发挥十分重要的作用,UPS的成员之一E3泛素连接酶对其功能特异性起着决定性作用。其中FBXO40,其在骨骼肌和心肌中作为一种E3泛素连接酶特异性高表达,已有研究证实FBXO40在骨骼肌萎缩中发挥重要调控作用,但其在心肌细胞中的功能研究未见报道。基于FBXO40在骨骼肌中的重要作用,而且其在心肌中也特异性高表达,本课题主要想探究FBXO40在心肌肥大过程中是否具有调控作用以及具有怎样的功能。方法本次研究中我们分别从细胞和动物水平上对FBXO40在病理性心肌肥大中的作用进行探究,结合荧光实时定量PCR(q PCR)、Western Blot、HE染色、鬼比环肽染色、免疫荧光等技术对相关指标进行检测分析,判定FBXO40在心肌肥大中的调控功能,具体实验方法如下:细胞水平:以大鼠乳鼠原代心肌细胞为材料,一方面我们通过苯肾上腺素(Phenylephrine,PE)进行药物诱导来构建体外心肌肥大模型,检测FBXO40的表达变化情况;另一方面,分别通过过表达和敲低心肌细胞中的目的基因FBXO40,检测肥大相关基因的变化情况。1.培养原代心肌细胞,PE分别诱导0、24、36、48小时后,通过荧光实时定量(q PCR)检测心肌细胞中肥大相关基因心房利钠因子(atrial natriuretic factor,ANF),脑利钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)的表达变化情况检测心肌细胞肥大水平。一方面通过鬼笔环肽染色法,荧光显微镜下观察细胞形态计算细胞表面积,另一方面利用q PCR技术检测药物诱导后心肌细胞中目的基因FBXO40的表达变化情况。2.我们逐一构建FBXO40的过表达载体和si-FBXO40(小干扰RNA),通过转染原代心肌细胞实现FBXO40的体外过表达和体外抑制。首先,用q PCR和Western blot技术检测目的基因FBXO40能否在心肌细胞中成功过表达和敲低,并在实现FBXO40过表达和敲低基础上,我们再提取RNA通过荧光实时定量q PCR检测心肌细胞中肥大相关基因ANF、BNP、以及β-MHC的表达变化情况。3.在上述研究基础上,分别设置对照组、PE诱导心肌细胞肥大组、PE诱导肥大同时转染si-FBXO40组以及转染si-FBXO40组,通过对各组细胞ANF、BNP和β-MHC表达水平以及细胞表面积的测定,进一步判定FBXO40在心肌细胞肥大过程中的调控作用,并通过鬼笔环肽染色法,荧光显微镜下观察细胞形态计算细胞表面积。动物水平:一方面利用尾静脉注射法向小鼠体内注射FBXO40干扰RNA的腺相关病毒载体(AAV-si FBXO40)敲低FBXO40在体内的表达水平,同时通过PE诱导心肌肥大,检测动物体内FBXO40敲低后对心肌肥大的影响;另一方面,我们制备了FBXO40敲除小鼠,检测FBXO40功能缺失后对PE诱导的心肌肥大的影响。1.通过设置对照组(生理盐水组)、PE组(尾静脉生理盐水+PE诱导)、PE+NC组(尾静脉注射阴性对照载体+PE诱导)、PE+AAV组(尾静脉注射AAV-si FBXO40+PE诱导),处理后各组小鼠利用超声心动实验检测心功能指标,统计分析左心室壁厚LVPW,短轴缩短率FS%以及左心室内径IVSd等指标变化情况;解剖小鼠后,测定心脏与体重比值、利用HE染色和WGA染色观察心脏及心肌细胞的表型变化情况。2.制备FBXO40敲除鼠,设置野生鼠、FBXO40敲除鼠、PE诱导野生鼠、PE诱导FBXO40敲除鼠,诱导结束后分别检测各组小鼠的心功能(射血分数EF%,短轴缩短率FS%以及左心室内径IVSd)及心脏表型情况,包括心脏与体重比值、心室壁厚度、心肌细胞面积的测定等。结果1.细胞水平验证敲低FBXO40可以抑制PE诱导的心肌细胞肥大。培养原代心肌细胞,0、24、36、48小时四个时段PE成功诱导心肌细胞肥大q PCR结果显示肥大相关基因ANF,β-MHC的表达变化在36h时肥大效果最佳;继续探究通过鬼笔环肽染色法,发现在荧光显微镜下观察细胞形态计算细胞表面积加药组较空白组比较明显增大;利用q PCR技术检测药物诱导后心肌细胞中目的基因FBXO40的表达情况显著上调;在实现FBXO40过表达和敲低基础上,提取RNA通过荧光实时定量q PCR检测心肌细胞中肥大相关基因ANF、BNP、以及β-MHC的表达分别呈上调和下调的趋势;在此基础上我们又进一步验证了结果显示,PE诱导肥大同时转染si-FBXO40组的ANF和BNP表达量显著低于PE诱导心肌细胞肥大组;WB检测结果显示,PE诱导心肌细胞肥大组的FBXO40蛋白表达显著上调,而PE诱导肥大同时转染si-FBXO40组的FBXO40蛋白表达水平相比PE诱导心肌细胞肥大组显著下调,此外,鬼笔环肽染色法结果显示PE诱导肥大同时转染si-FBXO40组的细胞表面积显著低于PE诱导心肌细胞肥大组。2.动物水平验证抑制FBXO40可以抑制心肌肥大。超声心动实验检测心功能指标,统计分析射血分数EF%,短轴缩短率FS%以及左心室内径IVSd显示敲除FBXO40降低了由PE诱导而升高的指标;解剖小鼠后,测定心脏与体重比值、利用HE染色和WGA染色观察心脏及心肌细胞的表型变化情况,观察HE染色结果显示AAV+PE组小鼠心脏大小,心脏体重比以及心室壁厚显著低于PE诱导组和NC+PE组。WGA染色结果显示,AAV+PE组小鼠心肌细胞也显著低于PE诱导组和NC+PE组心肌细胞;进一步得出制备敲除鼠诱导结束后观察野生鼠、FBXO40敲除鼠、PE诱导野生鼠、PE诱导FBXO40敲除鼠,诱导结束后分别检测各组小鼠的心功能及心脏表型情况,包括心脏与体重比值、心室壁厚度、心肌细胞面积的等均无明显差异,说明FBXO40敲除后对小鼠健康及心功能无影响。结论:FBXO40对心肌细胞肥大具有正向调控作用,体外与体内敲低FBXO40均能抑制PE诱导的心肌肥大水平。结论如下:1.利用PE诱导肥大的心肌细胞中目的基因FBXO40的表达显著上调;2.体外过表达或抑制目的基因FBXO40以后,心肌细胞肥大相关基因的表达呈相同趋势变化;3.体外敲低FBXO40能够抑制PE诱导的心肌细胞的肥大;4.体内敲低或敲除FBXO40能够抑制PE诱导的心肌肥大。