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目的:卵巢癌发病率第三位、死亡率最高的妇科恶性肿瘤,卵巢减灭手术联合顺铂和紫杉醇化疗是治疗卵巢癌的标准治疗方法,但是复发率高达70%-80%,五年生存率低至15%-38.7%,这与该疾病高度侵袭性、易化疗耐药有关。寻找卵巢癌的特有癌基因,深入研究卵巢癌多药耐药机制,靶向实施精准治疗是提高生存率的关键。我们前期研究通过微阵列基因芯片和q PCR验证发现mi R-1307可调控DAPK3(死亡相关蛋白激酶-3)介导卵巢癌耐药。DAPK3(死亡相关蛋白激酶3)DAPK蛋白激酶是家族成员,因其具有高度同源性的激酶催化结构,该家族蛋白具有调节细胞凋亡的功能外,还参与机体多种病理生理过程,如抑制肿瘤生长,调节凋亡、自噬、膜起泡应激纤维形成等,受到广泛关注。DAPK3具体机制复杂多变,收到广泛关注。本研究将对DAPK3基因对卵巢癌发生、发展和耐药机制开展研究。micro RNA(mi RNAs)是一类高度保守的长度20-25bp组成的单链非编码RNA,主要通过转录后修饰影响细胞的生长、发育、分化、增殖等生命过程,越来越多的证据显示的mi RNA表达与恶性肿瘤的转归息息相关。我们前期研究通过软件预测发现mi R-650的靶基因可能为DAPK3。mi R-650只有在人类中表达,位于22号染色体,在慢性白血病、结肠癌、胃癌中都用研究,在卵巢癌中尚无研究。我们对mi R-650、DAPK3之间的互做关系和在卵巢癌中的功能开展研究,为卵巢的早期诊断、靶向精准治疗提供新思路。研究方法:1.免疫组化、免疫荧光方法检测DAPK3在20例卵巢良性浆液性肿瘤、20例交界性肿瘤、30例卵巢化疗耐药、28例化疗敏感组织中表达,分析DAPK3的表达与卵巢浆液性癌组织化疗耐药的关系及与卵巢癌患者临床病理特征的关系。2.Western bolting和q RT-PCR方法检测DAPK3在18例卵巢良性浆液性肿瘤、11例交界性肿瘤、20例卵巢化疗耐药、20例化疗敏感组织中表达,Kaplan-Meier分析DAPK3蛋白表达与患者预后之间的关系;Western bolting和q RT-PCR方法检测DAPK3在卵巢上皮细胞Hosepic、卵巢癌耐药紫杉醇细胞SKOV3-TR30和其亲本细胞SKOV3、卵巢癌顺铂细胞COC1/ddp和其亲本细胞COC1的表达。3.使用Targetscan7.1(http://www.targetscan.org)、mi RNBASE等常用生物信息学软件预测mi R-650可能与Dapk3的3,UTR结合。构建mi R-650过表达载体和空载载体,构建告基因野生型质粒(pmir-DAPK3)及其突变型质粒(pmir-DAPK3-mut),重组载体经PCR电泳和基因测序鉴定,以证明重组载体构建成功。使用转染试剂分别将这两种重组载体质粒与mi R-650模拟物(mimics)或mi R-650阴性对照(Negative Control,NC)共转染293 T细胞,双荧光素酶报告基因方法检测mi R-650对PMIR-DAPK3报告基因的结合抑制作用。4.q RT-PCR检测mi R-650在18个正常卵巢组织、11个卵巢交界肿瘤、40例卵巢浆液上皮组织(化疗敏感、化疗耐药各20例)中的表达,Kaplan-Meier分析mi R-650表达与患者预后之间的关系。5.在卵巢癌耐紫杉醇细胞系SKOV3-TR30转染mi R-650mimic(mimic NC)48小时,q RT-PCR检测DAPK3的RNA表达情况,western bolting检测DAPK3蛋白表达,Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒染色并通过流式细胞仪检测细胞凋亡。PI细胞周期试剂盒检测检测细胞周期变化。结果:1.免疫组化方法表明DAPK3在卵巢浆液癌组织中(75.8%)高表达,免疫荧光法发现DAPK3表达于胞浆。组化实验表明DAPK3卵巢浆液性化疗耐药组织中显著升高(p=0.007),分析DAPK3表达与卵巢癌患者临床病理特征的关系,结果表明DAPK3表达与分期(P=0.018)、淋巴结转移(P=0.022)有一定相关性,与肿瘤的分化显著相关(P=0.002),与年龄无关,(P>0.05)。2.q RT-PCR检测DAPK3在卵巢癌组织中高表达,显著高于正常卵巢组织(P=0.0003),显著高于卵巢交界肿瘤组织(P≤0.0001);m DAPK3在化疗耐药组织中表达显著高于化疗敏感组织。q RT-PCR检测m DAPK3在卵巢癌细胞表达显著高于卵巢上皮Hosepic细胞(P≤0.01),卵巢癌耐紫杉醇细胞系SKOV3-TR30中m DAPK3表达显著高于亲本细胞SKOV3表达(P≤0.01);卵巢癌耐顺铂细胞系COC1/DDP中m DAPK3表达与其亲本细胞COC1细胞差异不显著(P=0.103)。3.Western bolting检测DAPK3蛋白在卵巢上皮性浆液癌组织高表达,显著高于卵巢良性浆液性肿瘤组织和卵巢交界组织(P=0.001);Western bolting证明DAPK3在卵巢化疗耐药组织、细胞(SKOV3-TR30)中表达显著高于卵巢癌化疗敏感组织和细胞(图4,5)。Western检测40例卵巢浆液性癌组织分析DAPK3表达与预后之间的关系,Kaplan-Meier分析法采用Log-Rank检验比较发现高表达DAPK3的卵巢浆液性癌患者总体生存率低于低表达患者(P<0.05)。4.双荧光素酶报告实验表明,共转染mi R-650模拟物+野生DAPK3质粒与野生DAPK3质粒+空载载体相比,荧光素酶报告基因检测相对荧光值明显降低(11.4001和9.8707,P=0.018);而共转染的mi R-650模拟物+突变DAPK3质粒和空载载体+突变DAPK3质粒组之间荧光素酶报告基因检测萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶的活性差异不显著。5.q RT-PCR检测mi R-650在正常卵巢组织表达高于卵巢浆液性癌组织(p≤0.0001);mi R-650在卵巢化疗敏感组织中表达显著高于化疗耐药组织(P=0.002)。q RT-PCR结果示mi R-650在卵巢上皮Hosepic细胞高于各种卵巢癌细胞(P≤0.01)。卵巢癌细胞系SKOV3中mi R-650表达显著高于卵巢紫杉醇化疗耐药细胞SKOV3-TR30(P≤0.01);卵巢癌细胞COC1细胞与卵巢癌耐顺铂细胞系COC1/DDP中mi R-650表达差异不显著(P≥0.05)。Kaplan-Meier法分析采用Log-Rank检验比较发现高表达mi R-650组的总体生存率高于低表达组,差异具有非常显著性(P<0.01)。6.通过在SKOV3-TR30细胞转染mi R-650mimic(mi RNA mimic NC为对照组)48小时后,q RT-PCR检测m DAPK3表达差异不显著(P>0.05),western bolting检测DAPK3蛋白转染后显著降低(p≤0.01)。流式细胞仪检测凋亡显示,SKOV3-TR30转染mi R-650mimic与NC组相比,早期凋亡显著增加,存在显著差异(P<0.05),细胞中过表达mi R-650可增强卵巢癌凋亡作用。细胞周期检测结果表明转染mi R-650mimic与NC相比G1期比例增多(P=0.0138),S期(P=0.0057)、G2(P=0.0044)期比例降低,细胞阻滞与G2期。结论:1.在卵巢癌组织DAPK3显著高于卵巢交界肿瘤、卵巢良性上皮浆液性肿瘤组织,DAPK3高表达的预后差。2.DAPK3在卵巢癌细胞系表达显著高于卵巢癌上皮细胞;卵巢癌耐紫杉醇细胞DAPK3的RNA和蛋白的表达显著高于其亲本细胞,而在顺铂耐药细胞系和其亲本细胞表达差异不显著,DAPK3高表达与紫杉醇耐药有关。3.mi R-650与DAPK3,UTR区域直接结合。4.mi R-650在卵巢癌细胞和组织中低表达;在卵巢癌化疗敏感组织中表达量高于化疗耐药组织;在紫杉醇耐药细胞系中表达低于亲本细胞;在顺铂耐药和其亲本细胞表达差异不显著。mi R650表达量卵巢癌恶性程度负相关,可能与紫杉醇化疗耐药有关。5.mi R-650通过转录后水平负向调节DAPK3表达,在紫杉醇耐药细胞中过表达mi R-650可以有诱导卵巢癌细胞凋亡,将卵巢癌细胞有丝分裂阻滞G2期。6.mi R-650的表达缺失,导致DAPK3的过量表达可能是卵巢癌紫杉醇耐药的分子机制。过表达mi R-650可能成为逆转卵巢癌紫杉醇耐药的靶向方法。