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背景:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是全球高发的恶行肿瘤之一,在癌症发病率中位于第三位,死亡率中排第二位,是仅次于肺癌的肿瘤[1]。在我国,根据国家癌症中心公布的最新数据显示,结直肠癌的发病率居全国恶性肿瘤第三位,死亡率居全国恶性肿瘤第五位[2]。近年来关于左/右半结肠癌之间的差异性的研究逐渐成为结直肠癌领域的研究热点,多项研究显示,微卫星稳定（MSS）患者预后差于微卫星不稳定（MSI）患者;而且,同样合并肝转移的结肠癌中,右半MSS型结肠癌,相对于左半MSS型结肠癌和右半MSI型结肠癌相比,是预后最差的。我们前期结果发现HOXC6在右半MSS型结肠癌中的表达显著高于左半肠癌并且与CRC患者总生存呈负相关,同时功能实验表明,HOXC6过表达促进了 SW480细胞的生长、侵袭和迁移。因此,本研究旨在探索转录因子HOXC6在左、右半结肠癌中发挥效应的分子机制及远处转移中的作用,以期为MSS型左、右半结肠癌患者提供精准治疗的分子靶点。方法:前期工作已经筛选出MSS型左、右半结肠癌差异基因HOXC6,并进行了迁移、侵袭以及耐药细胞表型实验。本研究在原有基础上,采用CCK-8法检测HOXC6对肠癌细胞增殖能力的影响,平板克隆实验检测HOXC6对肠癌细胞克隆形成能力的影响,流式细胞术检测HOXC6对肠癌细胞周期的影响。在动物层面采用裸鼠皮下成瘤法检测HOXC6对肠癌细胞成瘤能力的影响,经裸鼠脾包膜注射肝转移法检测HOXC6对肠癌细胞转移能力的影响。为探究HOXC6下游调控分子机制,采用ChIP-seq寻找HOXC6下游靶基因,利用RNA-seq对比HOXC6过表达与对照细胞之间的差异表达基因,将ChIP-seq和mRNA-seq联合分析探寻HOXC6调控的靶基因及下游信号通路,同时用RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶报告基因实验筛选出MYC作为HOXC6的下游靶基因,随后我们通过JASPAR网站筛选出4个HOXC6与MYC结合的位点并在载体上突变位点序列,探索HOXC6与MYC的具体结合位点,同时用Western blot检测HOXC6的表达对主要调控信号通路上的标志蛋白的影响。结合ChIP-seq和mRNA-seq联合分析的结果,进一步通过非靶向代谢组学和临床血常规数据分析,研究HOXC6调控的代谢途径。结果:体外细胞实验证明HOXC6能促进结直肠癌细胞增殖,克隆形成,调控肠癌的细胞周期向G2期进展;体内动物实验证明HOXC6能促进肠癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力和促进肝转移。通过对RNA-seq数据分析,我们发现HOXC6过表达能引起407个基因的显著差异表达,其中表达量上调的基因有343个,下调的基因有64个。将显著差异基因进行KEGG富集分析,发现通路主要富集在MAPK、PI3K-Akt、Ras以及与代谢相关的信号通路上。同时GOBP提示,HOXC6在L-谷氨酸跨膜输入、D-天冬氨酸跨膜输入以及D-天冬氨酸转运等相关代谢通路显著富集。对ChIP-seq结果进行分析可知,KEGG结果显示,HOXC6调控的下游靶基因主要富集在Hippo、多能干细胞、Wnt以及与菌群相关代谢通路上。同时GOBP提示peak临近基因在细胞代谢以及氮化合物代谢通路上显著富集。我们进一步使用BETA法对RNA-seq和ChIP-seq进行联合分析。结果显示,受HOXC6直接调控的下游基因一共有1610个,其中上调基因634个,下调基因976 个。包括 MYC、NFATC4、FGFR4、LPIN1、HMGCR 等基因,其中 MYC 的Peak score较高,达29.17。对Peak临近基因进行KEGG通路富集,结果显示HOXC6调控的基因主要富集在多能干细胞、Wnt、AMPK、代谢通路中。RNA-seq及Chip-seq联合分析提示HOXC6对于肠癌肿瘤干细胞干性和代谢重编程有重要的调控作用。我们针对显著富集通路中的重要基因,进一步用RT-qPCR进行了验证,结果发现,HOXC6对MYC、FGFR4、LPIN等基因有正向调控作用。利用双荧光素酶报告基因实验,证实HOXC6能结合MYC的启动子区域,激活MYC的转录。通过JASPAR网站筛选出4个HOXC6与MYC结合的位点并在载体上进行位点突变,发现HOXC6与MYC具体结合位点为MYC启动子区域1178-1794,负义链,序列为:CGCATGAATTAACTACG。通过 Western blot 验证,发现HOXC6的表达能上调下游靶基因MYC的表达,在Wnt通路相关的分子标志物中能上调GSK-3β、β-catenin、c-MYC、c-JUN的表达。通过对非靶向代谢组学的分析,结果显示KEGG通路在代谢层面里主要富集在氨基酸和脂质代谢通路上,HMDB注释到代谢物集中在脂质、类脂分子和有机酸类里,LIPID MAPS注释到代谢物主要集中在甘油磷脂类和脂肪酸类里。另外我们对263例结直肠癌患者首诊时的生化检测代谢物进行分析发现,在结肠癌和直肠癌患者中,白蛋白、门冬氨酸氨基转移酶、低密脂蛋白、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、谷氨酰胺转移酶出现显著差异,而在左右半结肠癌患者中发现白蛋白、间接胆红素、门冬氨酸氨基转移酶、肌酐、尿酸、低密度脂蛋白、蛋白/球蛋白出现显著差异。结论:综上所述,MSS型左右半结肠癌差异基因HOXC6高表达提示肿瘤的恶性程度增高,HOXC6可通过靶向调控MYC基因以及下游的Wnt通路从而促进肠癌细胞的生长及肝转移的形成,同时影响脂质代谢,通过调控肿瘤的代谢重编程促进肿瘤的发生发展。