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实验目的:研究BMSCs减轻急性哮喘模型小鼠炎症反应的机制,进一步探讨BMSCs与DCs自噬以及哮喘之间的关系。实验方法:1.BMSCs通过抑制肺内树突状细胞自噬缓解哮喘模型小鼠病情将BABL/B小鼠分为对照组,哮喘组,BMSCs治疗组,分别造模后,通过流式细胞术检测小鼠肺内和纵隔淋巴结内树突状细胞及其表面共刺激分子表达比例;通过ELISA检测小鼠血清中的Ig E水平以及BALF液中的Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13和IL-10)水平;通过肺组织HE以及PAS染色观察肺内炎症细胞浸润以及粘液分泌情况。通过western blot检测肺内树突状细胞自噬蛋白表达情况。2.体外实验观察BMSCs是否通过抑制自噬调节树突状细胞功能分别收集体外培养的BMSCs与未成熟DCs(imature dendritic cells,im DCs),将BMSCs与im DCs预处理后,用LPS分别刺激对照组DCs(control bone marrow derived dendritic cells,Ctr-BMDCs)和BMSCs conditioned BMDCs,分别使用ELISA检测细胞因子(IL-6,TNF-α)的水平,FACS检测BMDCs表面共刺激分子的表达情况,刺激OTⅡT细胞增殖能力以及吞噬OVA抗原的能力,并通过加入自噬刺激剂进一步观察DCs这些功能的变化。3.体外实验观察IL-10对BMDCs自噬以及功能的影响。(1)在体外将BMDCs分为BMDCs组、LPS刺激组、IL-10-treated-BMDCs+LPS组。通过流式细胞分析检测BMDCs表面共刺激分子的表达情况以及刺激T细胞增殖情况,ELISA检测各组BMDCs分泌细胞因子的情况。(2)用IL-10预处理体外培养的im DCs后,将BMDCs分为ctr-BMDCs组,LPS刺激组,LPS刺激IL-10-conditioned BMDCs组,以及雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)+LPS处理IL-10-conditioned BMDCs组,通过流式细胞分析术检测BMDCs活化情况和刺激T细胞增殖情况,酶联免疫实验观察BMDCs产生细胞因子的能力,以及流式细胞术检测BMDCs摄取OVA抗原的能力。(3)用LPS刺激体外培养的im DCs,收集不同时间点的BMDCs,进行western blot检测自噬相关蛋白的表达情况,找到检测最佳时间点,并在这个时间点观察IL-10对LPS诱导BMDCs自噬的影响。4.实验数据处理以及统计学分析本实验过程涉及的所有实验数据采用Prism Graph Pad 6软件进行统计学分析,所有计量数据均以x±s表示。统计分析前先对各组数据先进行正态检验和方差分析,符合正态分布和方差齐性的数据采用单因素方差分析,不符合正态分布和方差齐性的数据则采用Kruskal-Wallis检验。结果以P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果:1.BMSCs能通过抑制肺BMDCs自噬和功能缓解哮喘模型小鼠病情(1)BMSCs处理组小鼠肺组织切片炎症细胞数和粘液分泌水平、肺泡灌洗液中的细胞总数和嗜酸性粒细胞数、肺泡灌洗中的Th2型细胞因子(IL-4,IL-5)以及血清中Ig E水平均明显低于哮喘模型组。而BMSCs处理组小鼠的肺泡灌洗液中的IL-10水平却明显高于哮喘模型组。(2)BMSCs处理组小鼠肺及纵隔淋巴结中的DCs比例以及表面共刺激分子表达情况均明显低于哮喘小鼠组,并且具有统计学意义(P<0.05)。(3)哮喘组小鼠肺DCs自噬水平明显高于对照组(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显增加),BMSCs处理后,肺内DCs自噬水平明显降低,并且具有统计学意义(P<0.05)。2.BMSCs可能通过抑制自噬调节树突状细胞功能(1)相比于ctr-DCs,LPS刺激后,BMSCs treated-DCs表面共刺激分子(MHCⅡ,CD86)表达明显降低,分泌IL-6和TNF-α的能力明显减弱,刺激T细胞增殖明显降低。差异均具有统计学意义(P<0.05)。(2)进一步通过加入自噬刺激剂雷帕霉素进行拯救实验发现,BMSCs对DCs的抑制作用,在加入雷帕霉素后得到完全或者部分恢复:加入雷帕霉素组,BMDCs表面共刺激分子CD86,MHCⅡ,CD40,CD80表达较单纯BMSCs处理组明显增加,分泌细胞因子(IL-6)水平也明显增加,并且均具有统计学意义。3.IL-10通过抑制自噬调节树突状细胞功能(1)在LPS刺激后,IL-10 treated-BMDC表面共刺激分子表达水平,刺激T细胞增殖能力以及分泌细胞因子(IL-6,TNF-α)的水平较ctr-BMDCs均明显降低,并且具有统计学意义。而这种抑制作用,在加入自噬刺激剂雷帕霉素后出现了逆转。并且具有统计学意义。(2)LPS能够刺激BMDCs发生自噬,并且在12小时时间点,可以观察到明显的自噬现象,并且IL-10处理后的BMDCs自噬水平较ctr-DCs明显降低(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显降低)。实验结论:BMSCs可以减轻急性哮喘模型小鼠的炎症反应,并且可能通过分泌IL-10抑制肺DCs自噬水平并负向调节其功能从而改善哮喘。