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背景与目的病理性心室重构是心力衰竭重要的病理生理基础,是众多心脏疾病发展至终末阶段的共同表型之一,而心肌纤维化在此进程中发挥重要作用,其中心肌成纤维细胞的活化与过度增殖、细胞外基质的异常沉积以及胶原蛋白的合成与降解失衡,是心肌纤维化的重要病理改变,目前临床上尚无针对性的治疗方法;另一方面,蛋白质的类泛素化（neddylation）修饰与多种纤维化疾病相关,研究发现,neddylation关键调控蛋白（DCN1）抑制剂可显著缓解小鼠肝损伤,但是它在抗心脏纤维化方面的研究较少;本课题组前期工作发现DCN1表达水平升高与压力负荷引起的小鼠心室重构和心肌纤维化相关,DCN1的小分子抑制剂DN-2在体外水平可显著抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞的活化,尽管这样靶向DCN1抑制剂能否在动物水平缓解心室重构及心肌纤维化尚不清楚。本课题的研究内容是依据实验室前期建立的DCN1小分子抑制剂筛选平台,进行新型DCN1抑制剂的筛选,并对优化获得的化合物进行选择性、亲和性和靶向性评价,进一步评价其在体外对心肌成纤维细胞活化的抑制作用以及在小鼠体内的抗心室重构的作用,并进行相关机制探索。方法和结果1.DCN1抑制剂的筛选及亲和性、靶向性验证。依据实验室前期已建立的DCN1-UBC12抑制剂筛选平台,通过使用HTRF技术对课题组化合物库进行了体外活性筛选,发现了化合物6b对DCN1-UBC12的半数抑制浓度(IC50)为9.39±1.01 n M,通过检测它对DCN家族蛋白的结合作用,发现化合物6b对DCN1有较好的选择性;接着使用生物膜层干涉实验和细胞热迁移实验评价化合物6b对DCN1的亲和性和在细胞水平的靶向性,结果显示:与本课题组前期报道的化合物DN-2相比,化合物6b对DCN1具有更好的靶向性和亲和性。2.化合物6b体外对心肌成纤维细胞的活化、迁移和胶原分泌的影响及机制。本实验使用AngⅡ和TGF-β两种方式诱导心肌成纤维细胞的活化,使用MTT实验、划痕实验和Transwell实验检测心肌成纤维细胞增殖和迁移,通过Western blot实验检测AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞的活化以及胶原分泌。结果显示,化合物6b可显著抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞的增殖和迁移,降低心肌成纤维细胞中α-SMA,CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达;化合物6b对AngⅡ诱导的上述心肌成纤维细胞活化的缓解作用与其抑制DCN1和UBC12的相互作用,进而抑制Cullin 3的类泛素化,导致其下游Nrf2和NQO1的蓄积有关,这些结果表明体外水平化合物6b抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞活化与其抑制DCN1的活性相关。此外,与本课题组之前报道的化合物DN-2相比,化合物6b具有更好的抗心肌成纤维细胞活化的作用。3.整体动物水平化合物6b的安全性及其对心室重构和纤维化的抑制作用研究。（1）通过单次大剂量（2 g/kg）灌胃给药进行急性毒性试验检测化合物6b在小鼠体内的安全性,病理学结果显示化合物6b对心、肝、脾、肺、肾均未显示明显毒性损伤,表明化合物6b具有较好的体内安全性;（2）药代动力学实验结果显示,化合物6b静脉给药,清除半衰期为1.9 h,最大血浆浓度为2147.1 ng/m L,口服给药,清除率为10.2 L/h/kg,清除半衰期为3.8 h,口服生物利用度为19.43%,表明化合物6b具有良好的体内药代动力学性质;（3）应用异丙肾上腺素（Isoproterenol,ISO）建立小鼠心室重构模型,选择美托洛尔（Metoprolol,Met）作为阳性对照药,将小鼠随机均分为6组:对照组,ISO模型组,ISO+Met组,ISO+化合物6b（25,50和100 mg/kg/d）,每组10只。通过小动物超声心动图检测小鼠心功能,测量小鼠心重体重比（HW/BW）、心重胫骨长度比（HW/TL）,采用H＆E染色检测心肌组织中细胞形态变化及Masson染色检测胶原沉积。结果显示,和对照组相比,ISO模型组EF%和FS%值分别下降了18.74%和30.75%,小鼠心脏体积增大,HW/BW和HW/TL显著升高,Masson染色显示组织胶原沉积量明显增加,H＆E染色结果显示心肌细胞排列紊乱,同时发现纤维化相关蛋白（CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA）表达明显升高,DCN1蛋白表达升高,引起Cullin 3类泛素化升高及下游Nrf2和NQO1的表达降低;与ISO模型组相比,ISO+化合物6b（25,50和100 mg/kg/d）处理组EF%和FS%分别升高10.9%、15.8%、20.7%和16.8%、24.1%、27.1%,组织中胶原沉积明显减少,提示纤维化面积降低,心肌细胞排列相对整齐,CollagenⅠ表达量呈剂量依赖性降低;上述变化趋势与阳性对照ISO+Met组一致;另一方面,化合物6b处理组可明显抑制DCN1与UBC12的相互作用,进而抑制Cullin 3的类泛素化导致其下游Nrf2及NQO1的蓄积。以上结果表明,整体动物水平化合物6b显示出良好的安全性和药代动力学性质,并可通过抑制DCN1与UBC12之间的相互作用,显著改善ISO诱导的小鼠心室重构和心肌纤维化。结论1.本研究筛选获得新型5-苯基三氮唑类DCN1小分子抑制剂——化合物6b(IC50=9.39±1.01 n M),对DCN1有较好的选择性、亲和性和靶向性。2.在细胞水平化合物6b可有效抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖与活化,此抑制作用与其对DCN1-UBC12相互作用抑制进而影响Cullin 3的类泛素化并引起Nrf2和NQO1蓄积相关。3.整体动物水平化合物6b显示出良好的安全性和药代动力学性质,并可通过抑制DCN1与UBC12之间的相互作用,显著改善ISO诱导的小鼠心室重构和心肌纤维化。4.化合物6b可作为靶向DCN1治疗心室重构和心肌纤维化的先导化合物进一步优化和开发。