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本文运用细胞培养、台盼蓝染色、细胞计数、MTS分析、流式细胞分析、RNA干扰、Western blot等细胞学分子生物学技术和方法,以Raji细胞、Daudi细胞、小鼠原代脾脏B细胞为实验对象,系统地研究了雷帕霉素抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活;雷帕霉素抑制hsBAFF激活Erk1/2依赖的B细胞增殖和存活机理;雷帕霉素通过PP2A-Erk1/2信号通路抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活机理;雷帕霉素通过抑制mTOR介导PP2A-Erk1/2信号通路抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活机理;雷帕霉素靶向mTORC1和mTORC2通路抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活机理;雷帕霉素通过Ca2+-CaMKⅡ依赖的PTEN/Akt-Erk1/2信号通路抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活机理。结果如下:1雷帕霉素抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活Raji细胞、Daudi细胞和/或小鼠原代脾脏B淋巴细胞在不同浓度hsBAFF(0.5-5μg/ml)刺激48h、或在不同雷帕霉素浓度(50-200ng/ml)预处理2h后经2.5 μg/ml hsBAFF刺激48 h,采用MTS分析法、细胞增殖计数、台盼蓝染色分析和流式细胞分析分别评估细胞增殖和存活表现。结果显示,hsBAFF以浓度依赖的方式促进B细胞的增殖和存活;雷帕霉素以浓度依赖方式削弱hsBAFF诱导的细胞增殖和存活。提示:雷帕霉素能抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活。2雷帕霉素抑制hsBAFF激活Erk1/2依赖的B细胞增殖和存活Raji细胞、Daudi细胞、小鼠原代脾脏B淋巴细胞在不同浓度雷帕霉素(50-200 ng/ml)预处理 2 h 后加 2.5 μg/ml hsBAFF 处理 12 h、或用 Erkl/2 抑制剂 PD98059(0.1-25 μM)预处理1 h后加2.5 μg/ml hsBAFF处理12 h、或联合Erk1/2抑制剂 U0126 (5 μM)、PD98059 (10 μM) 1 h 预处理后经 hsBAFF ( 1 和 2.5 μg/ml)刺激12h或48h、或用雷帕霉素(50和100ng/ml)预处理2h,联合PD98059(1和10 μM)预处理1 h之后加2.5 μg/ml hsBAFF处理12 h或48 h;在一些情况下,采用腺病毒持续激活MKK1活性(Ad-MKK1-R4F)或钝化MKK1活性(Ad-MKK1-K97M)、慢病毒干扰沉默Erk1/2( shRNAErk1/2)感染的的Raji细胞用雷帕霉素(100 ng/ml)预处理2 h后加2.5 μg/ml hsBAFF处理12 h或48h。结合MTS和细胞计数分析细胞增殖和存活表现,Western blot分析相关通路蛋白表达变化。结果显示,雷帕霉素以浓度依赖的方式抑制hsBAFF激活的Erk1/2通路;采用Erk1/2抑制剂PD98059,腺病毒钝化MKK1活性,慢病毒沉默Erkl/2都强化了雷帕霉素对hsBAFF激活的Erkl/2通路及B细胞增殖和存活的抑制作用,而持续激活MKK1能抵抗雷帕霉素的抑制作用。提示:雷帕霉素能抑制hsBAFF激活Erkl/2依赖的B细胞增殖和存活。3雷帕霉素通过PP2A-Erkl/2信号通路抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活Raji细胞、Daudi细胞和小鼠原代脾脏B淋巴细胞在不同浓度雷帕霉素(50-200 ng/ml)预处理 2 h 后加 2.5 μg/ml hsBAFF 处理 12 h、或以 100 ng/ml 雷帕霉素预处理2h,联合PP2A抑制剂Okadaicacid (OA,100nM)预处理1h,再以2.5 μg/ml的hsBAFF处理12 h或48 h;在一些情况下,采用腺病毒钝化PP2A或过表达上调PP2A活性,以100 ng/ml雷帕霉素预处理2 h,联合Erk1/2抑制剂 PD98059 (10μM)预处理 1 h,再以 2.5 μg/ml 的 hsBAFF 处理 12 h 或 48 h。然后,评价B细胞PP2A活性、计数细胞和MTS分析评估细胞增殖和存活,以及Western blot检测细胞相关蛋白表达变化。结果显示,雷帕霉素抑制hsBAFF刺激升高的去甲基化和磷酸化PP2A且关联着PP2A活性改变;PP2A抑制剂OA抵抗雷帕霉素抑制hsBAFF刺激增加的p-Erk1/2和B细胞增殖和存活;过表达PP2A增强雷帕霉素抑制hsBAFF诱导的p-Erk1/2和B细胞增殖和存活;钝化PP2A活性减弱雷帕霉素抑制作用。提示:雷帕霉素靶向PP2A抑制hsBAFF诱导B细胞Erk1/2通路激活及增殖和存活。4雷帕霉素通过抑制mTOR介导PP2A-Erk1/2信号通路抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活以Raji、Daudi和小鼠原代脾脏B细胞为实验研究对象,雷帕霉素100 ng/ml预处理2 h,再以2.5 μg/ml hsBAFF处理12 h或48 h;采用异常表达抵抗雷帕霉素但有活性的腺病毒mTOR-T (Ad-mTOR-T)、抵抗雷帕霉素但无活性的腺病毒mTOR-TE(Ad-mTOR-TE)感染Raji细胞,或运用慢病毒干扰沉默mTOR(shRNA mTOR),雷帕霉素100 ng/ml预处理2 h,再以2.5 μg/ml的hsBAFF处理12 h或48 h。然后,计数细胞和MTS分析评估细胞增殖和存活,以及Western blot检测细胞相关蛋白表达变化。结果显示,雷帕霉素抑制B细胞增殖和存活涉及阻滞hsBAFF刺激S6K1/4E-BP1和Akt信号通路;雷帕霉素以mTOR激酶活性依赖的方式激活B细胞PP2A抑制hsBAFF诱导Erk1/2激活及细胞增殖和存活;下调mTOR阻滞hsBAFF诱导B细胞PP2A抑制和Erk1/2激活及细胞增殖和存活。提示:雷帕霉素通过阻滞mTOR介导PP2A-Erk1/2信号通路抑制hsBAFF诱导B细胞增殖和存活。5雷帕霉素靶向mTORC1和mTORC2通路抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活Raji细胞和/或小鼠原代脾脏B细胞在100 ng/ml雷帕霉素和1 μM PP242单独预处理2 h后,经hsBAFF (2.5μg/ml)刺激12 h或48 h、或用100 ng/ml雷帕霉素预处理2 h,单独或联合20 μM Akt抑制剂X预处理1 h后经hsBAFF (2.5μg/ml)刺激 12 h 或 48 h;在一些情况下用 Ad-S6K1-wt、Ad-S6K1-ca、Ad-4EBP1-5A、Ad-myr-Akt、Ad-dn-Akt、shRNA Raptor、shRNARictor、shRNA Raptor/Rictor、shRNA S6K1 或 shRNA4E-BP1 感染 Raji 细胞,100 ng/ml 雷帕霉素或1μM PP242预处理2 h后经2.5 μg/ml hsBAFF刺激12 h或48 h。然后,计数细胞和MTS分析评估细胞增殖和存活,以及Western blot检测细胞相关蛋白表达变化。结果显示,mTORC1和mTORC2涉及雷帕霉素对hsBAFF的抑制作用,这被在沉默Raptor、Rictor或Raptor/Rictor的细胞中呈现增强雷帕霉素抑制hsBAFF诱导细胞增殖和存活的证据所支持;mTORC1/2的抑制剂PP242也能抑制hsBAFF诱导Survivin及细胞增殖和存活增加,并且这种抑制效果比雷帕霉素更有力;沉默S6K1、异常表达4EBP1-5A、钝化Akt活性、或和Akt抑制剂X联合处理也强化雷帕霉素对hsBAFF诱导B细胞增殖和存活的抑制作用,而S6K1-ca、沉默4EBP1、myr-Akt则削弱了雷帕霉素的抑制作用。提示:雷帕霉素靶向mTORC1介导的S6K1和4E-BP1通路及mTORC2介导的Akt通路抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活。6雷帕霉素通过Ca2+-CaMKⅡ依赖的PTEN/Akt-Erk1/2信号通路抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活Raji细胞和/或小鼠原代脾脏B细胞在100 ng/ml雷帕霉素预处理2 h,单独或联合 20 μM BAPTA/AM、100 μM EGTA、100μM 2-APB或 0 1M KN93 预处理1 h后经hsBAFF (2.5 μg/ml)刺激12 h或48 h;在一些情况下用Ad-PTEN、Ad-dn-Akt和shRNA CaMKⅡ感染Raji细胞,100 ng/ml雷帕霉素预处理2 h,20μM Akt抑制剂X或5 μM U0126预处理1 h后经2.5 μg/ml hsBAFF刺激12 h或48 h。结合MTS和细胞计数分析细胞增殖和存活表现,Western blot分析相关通路蛋白表达变化。结果显示,过表达PTEN和钝化Akt活性抑制了 hsBAFF激活的p-Erk1/2、Bcl-2以及Survivin的增加,并且强化了雷帕霉素和Akt抑制剂X以及U0126对以上蛋白活性以及细胞增殖和存活的抑制;BAPTA/AM、EGTA、2-APB与雷帕霉素联合或单独处理均能抑制hsBAFF激活的p-PTEN、p-Akt、p-Erk1/2、Bcl-2和Survivin以及B细胞的增殖和存活,并且联合处理的抑制作用更强;KN93抑制或RNA干扰下调CaMKⅡ都抑制hsBAFF激活p-CaMKⅡ、p-PTEN、p-Akt、p-Erk1/2、Bcl-2和Survivin以及B细胞增殖和存活,并且能强化雷帕霉素对以上蛋白的抑制作用。提示:雷帕霉素通过Ca2+-CaMKⅡ依赖的PTEN/Akt-Erk1/2信号通路抑制hsBAFF刺激B细胞增殖和存活。