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研究背景三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是一种具有挥发性的卤代烃类有机溶剂,由于其对金属零件具有良好的清洗和去脂作用,在工业上得到了广泛的应用。部分职业工人接触TCE后会发生职业性三氯乙烯药疹样皮炎(Occupational medicamentosa-like dermatitis due to trichloroethylene,OMDT),由于该病病情进展迅猛,病死率较高,治疗周期长,给患者带来了巨大的经济负担和健康损失,肾脏损害是其重要的临床表现之一。对于OMDT的发病机制,研究发现除了迟发型IV型变态反应以外,补体系统在其中也发挥了重要的作用。课题组前期动物实验研究发现,补体3(Complement 3,C3)片段大量沉积在肾小球足细胞上。相关研究发现,在包含足细胞在内的多种细胞中能够通过细胞内部的组织蛋白酶L(Cathepsin L,CTSL)将细胞内合成的C3切割成具有生物活性的C3a和C3b片段致使细胞内补体激活,进而产生一系列的生物学效应。研究目的本研究在三氯乙烯致敏小鼠的模型基础之上,在部分小鼠体内腹腔注射CTSL抑制剂。通过检测不同组别小鼠肾脏足细胞上C3片段,CTSL和足细胞标志蛋白的表达以及肾功能水平,探讨足细胞内补体激活在三氯乙烯致敏小鼠免疫性肾损伤中的作用。研究方法将购买的120只无特定病原体级雌性BALB/c小鼠,随机分为空白对照组(15只)、溶剂对照组(15只)、TCE处理组(45只)和TCE+CTSL抑制剂联合处理组(后续简称CTSL抑制剂处理组,45只)。按照课题组成熟方法建立TCE致敏模型,于末次激发后24h,72h和7d各处死一批动物,收集相应生物样本。使用肌酐(Creatinine,CRE)和尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)试剂盒检测血清CRE和BUN水平,酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血清胱抑素C(Cystatin C,Cys-C)和尿液足细胞标志蛋白Podocalyxin(PCX)的表达水平,免疫组化检测肾脏C3片段,CTSL和足细胞标志蛋白Nephrin的表达情况,免疫荧光检测足细胞上C3片段和CTSL表达情况,蛋白质印迹(Western Blot)法检测肾脏皮质C3片段,CTSL和Nephrin蛋白表达水平,透射电镜观察足细胞超微结构损伤情况。研究结果1.致敏情况整个实验过程中空白对照组和溶剂对照组小鼠皮肤未见明显异常,TCE处理组和CTSL抑制剂处理组中部分小鼠实验部位皮肤出现不同程度的红斑和水肿,其中TCE处理组致敏率为33.3%(15/45),CTSL抑制剂处理组致敏率为31.1%(14/45)。2.肾功能检测结果溶剂对照组与空白对照组CRE,BUN,Cys-C,PCX水平相比,差异均无统计学意义(P>0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏24h组Cys-C,PCX表达水平升高,TCE致敏72h组四种指标表达水平均显著升高,TCE致敏7d组CRE,Cys-C和PCX表达水平有所升高,差异均具有统计学意义(P<0.05);而CTSL抑制剂致敏组在各时点部分指标与溶剂对照组相比也有所升高,但升高幅度与对应时点TCE致敏组相比均有所下降,差异均具有统计学意义(P<0.05);各处理组每个时点未致敏组指标表达水平与溶剂对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。通过检测四种肾功能指标发现,均在末次激发后72h达到最高峰,随后会恢复或逐渐降低。因此,在后续研究过程中均只检测72h时点各处理组的相关指标。3.肾脏组织中C3片段的表达情况免疫组化结果显示,C3片段主要表达在TCE致敏72h组的肾小球中,在CTSL抑制剂致敏组72h组见有少量表达,而在空白对照组、溶剂对照以及两个未致敏组均未见明显表达,组化评分结果发现TCE致敏72h组与其他各组相比评分明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫荧光结果显示,在六个处理组中,C3片段主要表达在TCE致敏72h组肾小球的足细胞上,其他各组均未见明显的C3片段表达;采用Western Blot法检测肾脏皮质中i C3b的表达,溶剂对照组与空白对照组及两个未致敏组相比,差异均无统计学意义(P>0.05);TCE致敏72h组iC3b表达水平与溶剂对照组相比明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与TCE致敏72h组相比,CTSL抑制剂致敏72h组iC3b表达水平显著下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.肾脏组织中CTSL的表达情况免疫组化结果显示,CTSL在各处理组肾小球均有所表达,其中在TCE致敏72h组的肾小球表达明显增多,组化评分结果显示,在TCE致敏72h组中的评分显著高于其他各组,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫荧光检测也发现,CTSL主要在TCE致敏72h组的足细胞上表达增多;Western Blot法检测肾脏皮质中CTSL的表达,分析结果与免疫组化结果一致。5.肾脏组织中Nephrin的表达情况免疫组化结果显示,Nephrin在TCE致敏72h组表达显著下调,其余各组表达均无明显差异(P>0.05)。组化评分结果显示,TCE致敏72h组评分明显低于其他各组,差异具有统计学意义(P<0.05);通过Western Blot法检测肾脏皮质中Nephrin的表达情况,分析结果与免疫组化结果一致。6.足细胞超微结构损伤情况经透射电镜观察发现,在空白对照组、溶剂对照组和两个未致敏组中,足细胞的足突完整,基底膜厚度均匀,未见明显细胞器损伤;在TCE致敏72h组中,可见大量足突融合,基底膜不均质增厚,线粒体发生空泡样变性、嵴突断裂;而在CTSL致敏72h组中,仅可见部分足突融合,未见其他明显异常,损伤较TCE致敏72h组明显减轻。结论1.在TCE所致BALB/c小鼠免疫性肾损伤中,CTSL可能介导了足细胞内补体激活。2.足细胞内补体激活可能参与了足细胞的损伤过程,使得足突广泛融合、基底膜不均质增厚、线粒体发生空泡样变性和嵴突断裂,进一步造成肾小球滤过功能下降,在TCE所致免疫性肾损伤中可能发挥着重要作用。