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目的: 探讨人外周血来源的间充质干细胞(MSCs)的体外分离扩增、培养生长以及诱导分化成有功能的肝样细胞的可行性。
方法: 抽取经粒细胞集落刺激因子(G-CSF)充分动员及未经动员的成人外周血15-55ml,应用密度梯度离心法及使用特殊的RosetteSep? Human MesenchymalStem Cell Enrichment Cocktail 试剂,分离外周血中的MSCs,贴壁纯化扩增。实验中发现G-CSF 动员过的外周血中造血系来源细胞过多,最终选用将未动员外周血中得到的MSCs 进行表型鉴定,并在HGF、FGF-4 和OSM 诱导下分化成为肝样细胞。使用免疫荧光染色、Westernblot、RT-PCR、电镜等方法检测分析肝样细胞的功能和诱导分化能力。
结果: 在经G-CSF 充分动员的外周血中可以密度梯度离心法分离获得MSCs,数目约为33106,但造血系细胞过多,影响培养结果。在未经动员的成人静脉血中,应用RosetteSep? Human Mesenchymal Stem Cell Enrichment Cocktail 分离可以获得MSCs,数目约为0.7-0.93106,并通过流式细胞仪检测细胞表面抗原进一步证实。所得细胞经过贴壁纯化扩增和诱导分化,利用光镜观察细胞形态、免疫荧光标记检测细胞对于ALB及AFP 的表达、Westernblot 检测蛋白水平上ALB和AFP的表达、RT-PCR 检测基因水平上ALB 和AFP 的表达、电镜检测所得细胞的超微结构等方法,显示其为有功能的肝样细胞。
结论:
1.人外周血中存在有MSCs 并且可以使用非侵袭性的方法提取分离。
2.人外周血中分离所得的MSCs 具有诱导分化成有功能的肝样细胞的能力。
3.此种方法可能为以后的肝组织工程研究提供新的种子细胞来源。