论文部分内容阅读
本论文针对沉积物中异养生物生物量大而影响真核藻类多样性分析的问题，利用一系列生物信息学手段对核酸数据库进行分析，设计出一对特异性针对真核藻类细胞核编码核糖体小亚基rDNA基因（small subunit nuclear ribosomal DNA，SSU nrDNA）的PCR引物并通过纯种与沉积物DNA验证了其针对真核藻类的高敏感性与高特异性。在此基础上，将该对引物应用于长江口及其水域沉积物真核藻类多样性研究，发现黄、东海表层沉积物中蕴藏着丰富真核藻类资源。通过构建真核藻类特异性PCR体系，为了解沉积物中真核藻类物种多样性提供了一种新的手段，避免了通用引物PCR扩增沉积物DNA后大规模的文库建立与筛选过程，降低了成本，使得大规模采样分析成为可能，以期为沉积物中真核藻类群落时空分布的研究提供方法学基础。研究的主要结果如下：通过构建SSU nrDNA数据库、利用Primrose生成备选特异性引物、TestProbe分析引物-模板错配位点，并结合前人关于引物模板错配对扩增效率影响研究成果，设计得到一对真核藻类18S rDNA特异性引物968F-1643R。从数据库层面上看，除可能存在原生动物一些类群非特异扩增外，该对引物总体上是一对针对真核藻类敏感性与特异性均较高的引物。为了验证数据库研究结果的正确性，开展了利用纯种DNA与沉积物DNA的验证工作。7个主要真核藻类门的7种真核藻类，以及2种真菌、1种甲壳类动物、1种纤毛虫的基因组DNA，被用于引物PCR扩增验证。优化实验条件后的电泳结果显示，7种真核藻类基因组DNA都得到扩增，4种非真核藻类生物未被扩增；相反，通用引物PCR结果显示11种基因组DNA都得到了扩增，沉积物DNA通用引物克隆文库则因异养生物量大、测序的克隆子数有限而未能检测到真核藻类。一系列结果初步证实了数据库研究结果的可靠性。在此基础上，利用引物968F-1643R对长江口水域表层沉积物DNA进行了扩增并构建克隆文库。5个站位挑取250个克隆子测序，按相似度97%定种共发现70个可操作分类单元，其中硅藻17种，甲藻24种，其他藻类24种，非藻类真核生物5种。这一结果表明长江口外海区表层沉积物存在一定的真核藻类多样性以及不同于盐沼湿地、潮间带的沉积物真核藻类群落结构。