丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一。目前全球约有一亿八千万人感染HCV(平均感染率约3%)。在我国,HCV是仅次于乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)引起慢性肝炎的因素。2002年全国病毒性肝炎流行病学调查结果显示,我国丙肝抗体阳性率为3.2%,全国有近4000万人感染HCV。而一旦感染HCV将有50%-80%的患者进展为慢性丙型病毒性肝炎。慢性丙型肝炎中,20%-30%的患者在感染HCV 20-30年后会进展为肝硬化及肝癌。据统计,全球50%以上的肝移植是因为丙肝相关终末期肝病引起的,而且因为HCV感染呈现慢性、隐匿的特点,随着病程的进展,丙肝相关终末期肝病病人的数量在未来二十年内会继续增长,将造成巨大的疾病负担和公共健康问题。HCV是黄病毒科(Flaviviridae),肝炎病毒属成员,其基因组为单股正链RNA,全基因组约9.6kb。由于HCV复制所依赖的聚合酶缺乏校对功能,HCV基因组序列易发生突变,呈现高度异质性。根据现有HCV分离株的数据,HCV基因异质性可分为以下4个层次：(1)HCV基因组的核苷酸序列的变异>30%时,称为基因型(genotypes),目前有6种基因型；(2)HCV基因组的核苷酸变异>25%称为基因亚型(subtypes),目前有80多种基因亚型；(3)HCV基因组的核苷酸变异>10%时,称为分离株(isolates);(4)准种(quasispecies),是HCV感染者体内同时存在的、多种不同序列组成的、并有很高同源性(同源性≥95%)的HCV变异株群体。在这4个层次中,HCV基因型及亚型的研究具有重要的流行病学及临床意义：1、在世界范围内,HCV基因型分布存在明显的地区差异和人群差异,而且某一地区的基因型分布也会随着时间的推移不断变化。因为人口流动和对献血者进行抗-HCV筛查的影响,我国HCV基因型分布也正在发生变化；2、不同基因型患者的临床表现和疾病严重程度有差异。多数学者认为基因1型与肝癌的发生相关；基因1型,特别是1b亚型与慢性丙肝进展为严重肝病相关；基因3型是肝脏脂肪变的独立预测因素；3、基因型与治疗疗效相关。在长效干扰素加利巴韦林的标准治疗方案中,基因1型及4型的治疗效果明显劣于基因2、3型；4、基因型的研究对疫苗的研制有重要意义。本研究首先通过同时扩增HCV种属信息区NS5B和高度保守区5’UTR基因序列,测序后序列比对及系统进化树分析精确检测HCV基因型和亚型,初步分析HCV基因序列的特点及广东地区HCV基因型及亚型的分布现状；然后根据LiPA的技术原理,针对HCV 5’UTR和C区设计特异性引物及探针,应用PCR-反向点杂交法,建立检测HCV 1b,2a,3a,3b和6a亚型的HCV基因分型方法；通过对我院慢性丙型肝炎患者进行随访,进一步探讨广东地区HCV基因型分布转变的临床意义及特点。本学位课题研究可概括为以下三个方面：联合分析HCV种属信息区NS5B和高度保守区5’UTR基因序列确定HCV基因型及亚型本研究通过同时扩增HCV种属信息区NS5B和高度保守区5’UTR基因序列,直接测序后用系统进化树法对广东地区99例抗-HCV及HCV RNA双阳性血清进行基因分型。结果显示99例患者标本均准确分型,其中NS5B区段分型74例,5’UTR区段分型99例。HCV基因型和亚型的分布：1a亚型1例(1.0%)；1b亚型59例(59.6%)；1型7例(7.1%)；2a亚型11例(11.1%)；3a亚型2例(2%)；3b亚型2(2%)例；3型3例(3.1%)；6a亚型12例(12.1%)；另有2例(2%)标本在两区段分型不一致,5’UTR/NS5B区段分型分别为6a/1b和3a/1b,考虑为HCV重组体。两区段共同分型74例,72例标本在两区段基因型一致,2例标本在两区段基因型不一致。对NS5B区段进行系统进化树分析发现,广东地区的HCV 1b亚型存在3个主要的分离株,占全部1b亚型的86.3%(44/51)。本研究表明,基于NS5B区的进化树分析,能准确区分HCV基因亚型甚至同一基因亚型内的不同分离株,但是检测的灵敏度欠佳；基于5’UTR的进化树分析法,灵敏度较好,但检测基因亚型的能力不够。联合两区段序列分析,可提高HCV分型的特异性及灵敏度,并对重组体的检测有重要意义。二、丙型肝炎病毒基因分型的PCR-反向点杂交技术的建立和应用根据LiPA技术原理,针对HCV基因组5’UTR和C区设计特异性引物及探针,采用RT-PCR体外扩增法和DNA反向点杂交技术,检测我国HCV常见的基因亚型1b、2a、3a、3b和6a。通过对115份慢性丙肝患者血清进行基因型检测,明确检测基因亚型111例,灵敏度为96.5%；而15份健康对照血清检测均为阴性,特异度为100%。111例明确分型的标本中1b型56.8%(63/111)；2a型8.1%(9/111)；3a型3.6%(4/111),3b型5.4%(6/111)；6a型25.2%(28/111),1b/2a混合型0.9%(1/111)。对其中的38份标本进行NS5B区段测序后进化树分析,两种方法分型结果完全一致,准确度为100%。本研究建立的PCR-反向点杂交法准确、可靠、经济实用,对我国常见HCV基因型检测的准确度好,灵敏度高,适于临床普及。三、广东地区HCV基因亚型的临床意义及流行病学特点本研究应用反向点杂交法检测南方医院门诊及住院慢性丙型肝炎患者的HCV基因亚型,通过对患者进行随访,了解广东地区亚型的分布现状及变化特点,探索广东地区HCV基因亚型分布的临床意义及流行病学特点。187例患者的HCV基因亚型为：1a亚型1.1%(2/187)；1b亚型64.2%(120/187)；2a亚型8.6%(16/187)；3a亚型4.3%(8/187),3b亚型2.1%(4/187)；6a亚型19.8%(37/187)。对不同年龄组的感染途径、基因亚型分布的研究发现,大于40岁年龄组中患者感染途径以输血为主,HCV基因亚型以1b为主；小于40年龄组的患者感染途径以非输血为主、基因亚型以非1b为主,两组比较有统计学意义。各基因亚型组患者在年龄及性别构成比例上有差异,1b亚型患者年龄偏大,6a亚型患者年龄偏小；1b患者的女性比重偏高,6a患者的男性比重偏高；不同基因亚型患者在HCV RNA、肝功、血脂、血糖等实验室指标的比较,差异无统计学显著性意义。结论1、基于NS5B区段的系统进化树分析法能精确检测HCV基因亚型,并发现广东地区HCVlb亚型存在3个主要的病毒株。2、基于5’UTR的系统进化树分析法有较好的灵敏度,但检测基因亚型的能力不够。3、联合HCV多区段分型能提高检测HCV基因型的准确性及灵敏度。4、本研究建立的PCR-反向点杂交法对我国常见的HCV基因亚型1b、2a、3a、3b和6a检测的准确性、特异性及灵敏度较好,适宜于我国临床推广应用。5、广东地区慢性丙型肝炎患者HCV基因亚型分布以1b为主,其次为6a、2a,3a、3b也占有一定比例。6、广东地区慢性丙型肝炎患者中低年龄组(<40岁)患者的感染途径以非输血为主,基因亚型以非1b为主。7、广东地区慢性丙型肝炎患者中,1b亚型患者的年龄偏大、女性患者所占比重偏高,6a亚型患者的年龄偏小、女性患者所占比重偏低。在所研究的样本中进行组间比较,HCV各基因业型在病毒载量、肝功、空腹血糖、血脂等检查指标上的差异无统计学显著性意义。