论文部分内容阅读
目的:运用RNAi抑制胃癌细胞株BGC-823中人DNA甲基转移酶1(Human DNA methylation transferase 1,hDNMT1)基因的表达,当DNMT1基因沉默后观察胃癌细胞株BGC-823中p16基因的表达情况。方法:在GenBank中查找hDNMT1的mRNA核苷酸序列,并根据序列设计并合成shRNA序列,以此为模板构建siRNA质粒1,2,3和阴性对照siRNA质粒b,对含有质粒的大肠杆菌进行培养并提取出质粒,测量质粒浓度后进行质粒DNA电泳确认质粒大小。胃癌细胞培养后接种于六孔培养板中,隔日经脂质体转染胃癌细胞株BGC-823,分转染组(siRNA质粒1、2、3)、阴性对照组siRNA质粒b和空白对照组0,继续培养48-72小时后通过荧光显微镜观察转染效率,收集转染效率较好的细胞进行后续实验。对DNMT1基因行Q-PCR检测其mRNA表达水平及western-blot检测其蛋白表达水平,确认其表达下调后筛选出最佳干扰质粒。以同样的方法检测胃癌细胞最佳干扰组、阴性对照组和空白对照组的p16基因的表达情况,以确认抑制DNMT1基因表达后对胃癌细胞p16基因的影响。结果:RNAi可有效抑制胃癌细胞株BGC-823中DNMT1基因的表达,用Q-PCR方法对转染后的胃癌细胞DNMT1基因检测mRNA表达情况,结果显示,转染siRNA质粒2(0.3253±0.0301)的胃癌细胞中DNMT1的mRNA表达明显低于其他转染组、阴性对照组(1.0087±0.1584)及空白对照组(1.8576±0.5603),经过SPSS17.0计算,P<0.05,结果有统计学意义;对转染siRNA质粒1(0.7095±0.1154)和siRNA质粒3(0.6163±0.1110)的mRNA表达进行比较,经过SPSS17.0计算,P>0.05,结果无统计学意义;各转染组的mRNA表达均低于阴性对照组和空白对照组,阴性对照组的mRNA表达低于空白对照组,结果均有统计学意义。用Western Blot法检测DNMT1基因蛋白表达情况,转染siRNA1、2、3的胃癌细胞DNMT1基因蛋白表达量分别为0.6772±0.0203、0.5114±0.3866、0.6218±0.0304,结果与PCR的结果相似,对阴性对照组(0.8135±0.0224)和空白对照组(0.8164±0.0734)的DNMT1基因蛋白表达进行比较后,P>0.05,结果无统计学意义,由此筛选出最佳干扰质粒siRNA质粒2。分别用Q-PCR、Western Blot方法检测胃癌细胞最佳干扰组、阴性对照组和空白对照组的p16基因表达情况,结果显示,最佳干扰组的mRNA(1.6727±0.2242)及蛋白(0.9227±0.0337)表达水平均高于阴性对照组(1.0025±0.0877)、(0.5440±0.0229)和空白对照组(0.4729±0.0940)、(0.4767±0.0774),经过SPSS17.0计算,P<0.05,结果有统计学意义;比较阴性对照组和空白对照组的p16蛋白表达情况,经过SPSS17.0计算,P>0.05,结果无统计学意义。结论:由DNMT1基因引起的抑癌基因p16启动子区的异常甲基化可能是促进胃癌发生发展的一个重要因素,用RNAi可以抑制胃癌细胞DNMT1基因的表达从而使p16基因去甲基化,使p16恢复表达,抑制胃癌的发生发展,为临床治疗胃癌提供了新的思路。