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20世纪70年代初，Folkmall首先提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”的论点。到目前为止，已经证实了肿瘤的生长和转移必须有新生血管提供氧气和养料，而血管新生是在原有的毛细血管或微静脉基础上，通过内皮细胞的增殖和迁移，从先前存在的血管处以芽生或非芽生的形式生成新的毛细血管，是胚胎发育时期和女性月经周期子宫内膜周期性剥脱修复时血管形成的主要方式，同时也是病理状态下比如损伤后修复主要方式。血管新生主要受两方面因素的调控，一是促血管形成因子的增加，二是抑制血管形成因子的减少。在生理状态下血管生成促进因子和抑制因子之间达到一个平衡，但是在肿瘤的增大和转移的过程中，血管新生促进因子占据了优势，因此，如果抑制新生血管的形成，肿瘤细胞将发生凋亡或坏死，这就为抗肿瘤的治疗开辟了新的思路。
目前，有多种抑制血管新生的药物用于抗肿瘤治疗的研究，单链的高分子量激肽原(HK)是一个分子量约为120kDa的球蛋白，在血浆中的浓度约为90μg/ml，从结构上来说，HK 由六个结构域组成，其中1-3构成它的重链，5-6构成它的轻链，重链和轻链之间由包含有一个九肽的缓激肽的第四结构域相连。在血浆的激肽释放酶的作用下，释放出一个九肽的缓激肽以后就形成了一个由约62 kDa的重链和约56 KDa的轻链形成的双链分子，重链和轻链之间由位于第10位和596位之间的单一的二硫键连接。激肽释放酶进一步在该双链的第419位精氨酸和420位的赖氨酸之间酶切，使短链缩短为约46 KDa大小，这样形成的双链高分子量激肽原被称为活化的高分子量的激肽原(HKa)。HK和Hka在结构上都有第五结构域的富含组氨酸区域，第五结构域通过该区域与Zn<2+>结合，通过电镜的观察发现随着HK活化成为Hka后，它的构象发生了明显的改变，其最主要的特征就是它的第五结构域暴露，而第五结构域的暴露使Hka获得一个新的生物学活性，从而使它可以和活化的血管内皮细胞表面的尿激酶纤溶酶原激活受体(uPAR)特异的结合，从而使活化的内皮细胞去黏附而诱导内皮细胞的凋亡来抑制血管的新生。目前，对于Hka诱导内皮细胞凋亡，抑制血管新生的作用机制已经得到了比较明确的研究，对于其有功能的活性片段也已经进行了鉴定，但是对于单纯的用Hka来进行抗肿瘤的治疗仍存在不少的问题，动物实验显示，单纯用Hka来进行治疗会发现药物的剂量较大，而且起效所需时间长，因此，本课题通过将HK的活性片段D5<[8]>和具有强大的抗肿瘤活性、毒副作用小的肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体TRAIL<[13]>的活性片段进行融合，得到具有双功能作用的融合蛋白，特异性的杀伤肿瘤细胞和肿瘤新生血管的内皮细胞。
本课题运用基因工程技术，分别获得KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>片段，分别鉴定其活性后，通过重组PCR技术，用氨基酸连接臂将两个活性片段双向重组连接，获得了KininogenD5<,60-148>—TRAIL<,114-281>(KT)和TRAIL<,114-281>—KininogenD5<,60-148>(TK)，将得到的重组蛋白进行活性鉴定，发现KT具有较强的抗肿瘤细胞和杀伤新生血管内皮的作用，而TK活性很小，在此基础上还初步探讨了KT诱导细胞凋亡的机制以及KT的抗瘤谱。
一、KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>的克隆、表达与活性鉴定
我们采用PCR技术分别获得KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>基因片段，分别构建pMAL-KininogenD5<,60-148>(PKD5)和pMAL-TRAIL<,114-281>(PT)的重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌E．Coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达及2.5 L发酵罐扩大培养，亲和层析，过滤，-80℃保存备用。
大肠杆菌表达的融合蛋白MBP/KD5和MBP/T在E．Coli BL21中的菌体总蛋白含量分别为25％和 23％，诱导后得到了有效的表达，超声破菌后，融合蛋白最主要在上清表达，经Amylose Resin亲和柱纯化后，获得了纯化的MBP/KD5和MBP/T融合蛋白，纯化后纯度分别达95％和 93％(Syngene扫描分析)，经Werstern B10t鉴定在52 kDa和62 kDa处得到相应的融合蛋白表达条带。
用上述纯化的PKD5和PT分别在ECV304和人胰腺导管上皮细胞SWl990上进行活性鉴定，在geltalin和fibranectin包被以及在VEGF存在的情况下，PKD5对内皮细胞有明显的抑制作用，如果没有Zn<2+>存在的情况下，ED<,50>为10μg/ml，当Zn<2+>浓度为10nmol/L时，ED<,50>为50ng/ml；PT对SW1990有明显的杀伤作用，ED<,50>为25 ng/ml。PT对于肿瘤细胞有明显的诱导凋亡的作用，是很好的抗肿瘤药物；通过管状结构形成实验，PKD5可以明显的抑制体外管状结构的形成，因此具有潜在的抗肿瘤活性。
二、利用重叠PCR技术将KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>双向融合表达
第一部分的研究结果表明了KD5和TRAIL的活性片段都具有生物学活性，因此，我们将两者的活性片段进行融合得到一种新型的融合蛋白。这种新型融合蛋白的靶向能力是利用配体KininogenD5<,60-148>和活化的血管内皮细胞上高表达的受体uPAR之间高度特异相互作用的特性和TRAIL<,114-281>和肿瘤细胞表面的死亡受体特异性结合的特性。因此，KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>融合蛋白具有靶向杀伤肿瘤细胞的能力，我们利用原核表达系统制备该融合蛋白。
首先，我们利用重组PCR技术，合成KininogenD5<,60-148>和TRAIL<,114-281>的双向融合基因KT和TK，Kininogen和TRAIL之间通过氨基酸连接臂相连，将融合基因分别克隆NpMAL-c2载体中，获得重组表达质粒pMAL－KT和pMAL－TK，转化E.coli BL21 (DE3)。SDS-PAGE分析显示，在IPTG诱导下，人pMAL－KT和pMAL－TK融合基因获得了有效表达，表达量约占菌体总蛋白质的25％左右，主要以可溶的形式表达，经Amylose Resin亲和柱纯化后，得到了纯度在95％以上的纯化蛋白MBP/KT和MBP/TK，利用纯化蛋白对内皮细胞ECV304和人胰腺胆管上皮细胞癌细胞SW1990的细胞毒实验，结果表明MBP/KT具有良好的双功能活性，对ECV304细胞的IC<,50>为30 ng/ml，对于SW1990细胞的ED<,50>为5 ng/ml，而MBP/TK对于ECV304细胞和SW1990几乎没有作用。我们进一步通过流式细胞检测，电镜检测，以及DNAladder检测，证实TMBP/KT可以明显的诱导SW1990细胞的凋亡。因此，我们进一步将KT亚克隆到表达载体pBV 220中进行表达，在热诱导下，pBV220/KT最主要以包含体的形式表达，通过改进发酵条件，最终得到了上清的少量表达。这些研究结果为肿瘤治疗开创了新的思路。